7. predavanje

MOLEKULARNA PATOFIZIOLOGIJA TUMORSKOG PREOBRAŽAJA SOMATSKIH STANICA Prof. dr. sc. Nada Oršolić Zavod za animalnu fiziologiju

HOMEOSTAZA MASENE TKIVNE RAVNOTEŽE 

Fiziološka tkivna masena ravnoteža se održava usklađenom: kontroliranom diobom kontroliranim odumiranjem stanica.



U tumorskim bolestima zbog povećanja mase dolazi do poremećaja masene ravnoteže.

Molekulska patogeneza tumorskog rasta i nastanka raščlanjena u četiri koraka: 1. nestabilnost genoma,

2. stjecanje diobotvorne neovisnosti stanice, 3. preživljavanje u nepovoljnom unutarnjem okolišu

4. metastaziranje tumora

Tumorski preobražaj uzrokuju •strukturnim i funkcijskim promjenama gena koji mogu uzrokovati tumorski preobražaj stanice.

Nestabilnost genoma uzrokuje sklonost

Stečena ili/i naslijeđena nestabilnost genoma preduvjet je pokretanja diobotvornih nekontroliranih mehanizama koji nastaju virusni proteini

•1.Mikrosatelitska nestabilnost, koja se očituje promjenom dužine mikrosatelita. •2. Kromosomska nestabilnost koja uključuje, strukturne promjene u kromosomu kao i promjene u broju kromosoma.

• Aktiviranjem protoonkogena, • disfunkcijom protuonkogena, • kočenjem apoptotskih mehanizama, ili • kombinacijom nekoliko tih uzročnika.

• interferencijom s dioboupravnim molekulskim procesima uzrokovati tumorski preobražaj.

Stanice koje su stekle diobotvornu neovisnost prolaze treći korak preživljavanja u nepovoljnom okolišu, pri čemu moraju svladati:   



genomsku, imunonadzornu i energijsku barijeru

Na tom se selektivnom koraku gubi velika masa novostvorenih stanica, što određuje relativno sporu kinetiku tumorskog rasta.

Bitni čimbenici za rast tumora:

Tumor

DIOBOUPRAVNI I SAMOUBOJSTVENI MEHANIZMI SOMATSKIH STANICA ODREĐUJU HOMEOSTAZU MASENE TKIVNE RAVNOTEŽE 

Preživljavanje složenog višestaničnog organizma ovisi o: 

 



funkciji posebno diferenciranih somatskih stanica koje oblikuju tkiva, o energijskoj i informacijskoj homeostazi.

Fiziološka se homeostaza tkiva i tkivnih funkcija održava ravnotežom između strogo nadzirane diobe stanica i njihove kontrolirane smrti.

SIGNALI POBUDE I SIGNALI KOČENJAFunkcijska i strukturna homeostaza 

Stanice primaju i odašilju komunikacijske signale pobude:   

 



Istodobno, stanice primaju i odašilju signale kočenja. Trenutni se zbir pobuda i kočenja integrira i to određuje fiziološko ponašanje stanice. Na molekulskoj se razini signali pobude u stanicama očituju:    



autostimulatornim, parastimulatornim i jukstastimulatornim mehanizmima.

lučenjem molekula, pokretanjem staničnog ciklusa u smislu diobe, promjenom izražaja dijelova genoma te pokretanjem programirane smrti stanica.

Funkcijska i strukturna homeostaza fizioloških tkiva se odražava u selektivnim prilagodbama koje se očituju na tkivnoj, staničnoj te molekulskoj razini.

Prijenos informacija 

Prijenos informacija se ostvaruje:    

 



proteinsko-proteinskim međudjelovanjima fosforilacijama proteina, proteinsko-DNA-interakcijama, lipidnim signalima, lipidacijom proteina te ionskim prijenosom signala.

Prijenosi signala u citoplazmi se sastaju na nekim križnim točkama različitih putova, koje time postaju integracijske točke na kojima se zbrajaju negativni i pozitivni signali. Takve točke fizioloških križanja putova signala su potencijalna mjesta za nastanak aberantne pobude stanice.

PRIJENOS INFORMACIJAPROCES SIGNALIZACIJE

Prijenos signala -signalizacija 



Prijenos signala evoluirao u cilju da pojedine stanice mogu odgovoriti na njihov izvanstanični okoliš. Važna u komunikaciji između stanica unutar tkiva i između tkiva:    

održavanje morfologije tkiva zacjeljivanje rana, prepoznavanje i uklanjanje mikroba, održavanje homeostaze.

Mehanizam signalizacije Ligand

Receptor

P

Aktivna fosforilacija/defosforilacija

Transkripcija Transkrpcija gena

Adaptor protein

nukleus MAP kinaze, • čimbenici transkripcije - Vezanje na konsenzus slijed promotora - Može stvoriti komplekse - Može se sama transkribirati i izazvati staničnu aktivaciju

Efektorni enzim

Tipovi signala 

Fiziološki signali iz vanjskog mikrookoliša 



Patološki signali iz vanjskog mikrookoliša 

 



Susjedne stanice, izvanstanični matriks, citokini i faktori rasta, hormoni, glukoza, amino kiseline, ioni itd molekularnih uzoraci vezani za opasnost (DAMPs) Patogeni molekularni uzorci (PAMPs) Upala i imunološke stanice

Interni homeostatski signali 

Odgovor na DNA i mitohondrijska oštećenja, ROS, hipoksija, metabolizam, itd

Većina signali se prenosi putem vezanja liganda za specifične receptore na površini stanice, čime se mnogi vanstanični podražaji mogu razlikovati

Više signalnih puteva sudjeluje u stvaranju odgovora Peptide hormones Odorants Chemoattractants Neurotransmitters Taste Ligands G-proteinR Hormones Lipid kinases Steroid R Extracellular Protein kinase R Cadherins GTP GDP matrix Integrins Tumor necrosis TNFR Pathogen Factor family family Associated Toll-likeR Molecular Cytokines CytokineR Nucleus Patterns (PAMPs) GlucoseR/ Damage Associated Ion channels Molecular Patterns (DAMPs) Growth Factors

Nucleus

• Više signala integrirano za generiranje odgovarajućeg biološkog odgovora, bilo da je to smrt stanica / opstanak, zastoj staničnog ciklusa / progresija, glikoliza / aerobik metabolizam, popravak DNA / stabilnost

Početni korak je aktivacija receptora ligandom izazvanih pomoću oligomerizacije Inaktivni receptori Cytokine Receptor RTK (EGFR, PDGFR)

Aktivirani receptori

ATP autophosphorylation

ADP

• dovodi do aktivacije receptora kinaza ili konformacijskih promjena koje omogućuju vezanje na adapter proteine ​te aktivaciju kaskadne reakcije Receptor se može povezivati s drugima -sinergizam npr erbB1 i 3 - može biti važnan u izbjegavanju odgovora na terapiju

Čimbenici rasta Čimbenici rasta

Tirozin kinaze

Fosfolipaza C

Ras/G

PI3 kinaze

Aktivacija MAP kinazne kskade (Ser/treonin kinaze) Aktivacija transkripcijski čimbenika Geni odgovorni za rast

Glavni igrači kinaze Tirozin kinaze (100 gena)

Serin / treonin kinaze (400) gen

Receptori faktora rasta (RTK, 60 gena) Citoplazmatski (35-40 geni) Jak, Src, Fak, Tec ...

MAP kinaze, TGFβR, PKC, ATM

Kinaze dvojne specifičnosti MEK (dvostruke treonin i tirozin kinaze)

Fosfataza

PTEN, Cdc25kontrola fosforilacije.

Tirozin kinaze, Receptorske (EGFR,FGFR,PDGFR)

Ne- receptorske (JAK,src,Abl,MAPK)

 Serine treonine (PKC, Plk,Rho Kinases)

Nekoliko primjera receptora TK 

Epidermal Growth Factor Receptor family • erbB1 (c-erbB) • erbB2 (neu) • erbB3 • erbB4



Fibroblast Growth Factor Receptor family • FGFR-1(fig) • FGFR-2(K-sam)



Platelet Derived Growth Factor Receptor family • CSF-1R (c-fms) • SLF R (c-kit)





Insulin Growth Factor Receptor Family  IGFR-1 (c-ros) Neurotrophins  NGFR (trk-A)  BDNFR (trk-B)  NT3 R (trk-C)

RTK Aktivirani receptor tirozin kinaza (RTK) 1. vezanje liganda 2. Dimerizacija 3. Autofosforilacija

Fosforilacija 

Promjena aktivnosti enzima iniciranjem kaskadne reakcije 



Indukcija vezanja DNA 



STAT i c-jun transkripcijski aktivnosti

Promjena substanične lokalizacije proteina  



npr MAP kinazni put iniciran aktivacijom EGFR pomoću autofosforilacije.

primjerice, regrutiranjenje adaptera na aktivirane receptore, nuklearna lokalizacija hormonskih receptora

Promjena stabilnosti proteina 

fosforilacija dovodi do degradacije ili stabilizacije - p27, IkBα, p53, itd.

Prijenos signala u stanici 1. DNA specifičnost i afinitet vezanja 2. Transaktivacijska aktivnost

Transkrpcijski čimbenici

1. Faktori rasta i /ili faktori inhibicije 2. Izvanstanične komponente 3. Stanica-stanica adhezijske interakcijske molekule

1. Protein-protein interakcija 2. Fosforilacija i defosforilacija 3. Lokalizacija

-Normalne stanice primaju signale iz okoline koja ih okružuje -poremećaj stanične signalizacije je ključan u nastajanja tumorskih stanica - stanica - stanica komunikacija je presudna za koordinirano djelovanje pojedinih stanica u višestaničnom organizmu

Čimbenici rasta – biološki učinci - proliferacija stanica - stanična diferencijacija - apoptoza - lokalna upalna reakcija - angiogeneza - stvaranje međustaničnog matriksa - progresija staničnog ciklusa

Faktori rasta i stanični ciklus Transkripcija gena

+

Receptors S

Priming G0

G1

Stanični ciklus

M

G2

Čimbenici staničnog rasta čimbenik struktura učinak receptor ___________________________________________________________________ EGF 130 kDa (prekursor) mitogen EGFR, RTK 6 kDa (fragment) (epitelne stanice) TGFα

25 kDa (prekursor) 6kDa

mitogen EGFR, RTK (epitelne stanice)

Amfiregulin

14-22 kDa

mitogen

HB-EGF

14-20 kDa

EGFR, RTK

mitogen EGFR/Erb4 kemoatraktant RTK Betacelulin 32 kDa mitogen EGFR/ErB4 (stanice dojke) RTK ___________________________________________________________________

Čimbenici staničnog rasta Čimbenik struktura učinak receptor ____________________________________________________________________ Heregulin 42-59 kDa diferencijacija ErB3-4, RTK maturacija PDGF-A/B

30 kDa 16-18 kDa (PDGF-A) 12 kDa (PDGF-B)

kemotaksija mitogeneza

PDGFRα PDGFRβ

FGF 1-9

17-30 kDa

mitogeneza angiogeneza

FGFR1-4, RTK

IGF-1 IGF-II

7, 5 kDa

proliferacija diferencijacija preživljenje

IGF-IR, RTK INS-R, RTK

Čimbenici staničnog rasta Čimbenik struktura učinak receptor _____________________________________________________________________ NGF 13-25 kDa mitogen trkA, RTK BDNF prekursor diferencijacija trkB, RTK (neuroni) NT3 trkC, RTK NT4 trkB, RTK GDNF

20kDa

preživljenje (neuroni)

ret, RTK

VEGF

34-46 kDa

mitogen (endotel)

Flt-1/FlK-1, RTK

_____________________________________________________________________

Čimbenici staničnog rasta Čimbenik struktura učinak receptor ______________________________________________________________ _ CSF-1 70-90kDa proliferacija c-fms, RTK (makrofagi) SCF

31-36 kDa

Flt-3L

30 kDa

proliferacija c-kit, RTK diferencijacija migracija hemotopoetskih stanica

proliferacija flt-3 RTK hemotopoetskih progenitora _____________________________________________________________

Čimbenici staničnog rasta Čimbenik struktura učinak receptor _____________________________________________________________________ HGF 60 kDa i 30 kDa pokretljivost met RTK morfologija epitelnih i endotelnih stanica MSP 47kDa i 22 kDa pokretljivost ron RTK morfologija makrofaga efrinA1-5 21-28 kDa mitogen EphA1-8 efrinB1-3 34 kDa EphB1-6

Gas 6

75 kDa

mitogen

Axl RTK Sky RTK _____________________________________________________________________

Čimbenici staničnog rasta Čimbenik struktura učinak receptor ____________________________________________________________________ Porodica TGF-β TGF- β1-3 BMP 2-8 Aktivin/inhibin

Porodica TNF TNF-α

28-30kDa

17 kDa

organizacija mezenhima indukcija mezoderma

TβR-II, TβR-1 BMPR-II, ActR-1 ActR-II, ActR-I

mitogen p55 TNFR citotoksičnost p75 TNFR angiogeneza apoptoza stanična athezija ____________________________________________________________________

Tumor

EGFR ekspresija

Dojka Kolon Plućni karcinom (ne malih stanica)

14 % - 91 % 25 % - 77 % 40 % - 80 %

Glava i vrat

80 % - 95 %

Ovarian

35 % - 70 %

Gušterača

30 % - 50 %

Percentage of Human Tumors Overexpressing EGFR Tumor type

Percentage of tumors

Bladder

31-48

Breast

14-91

Cervix/uterus

90

Colon

25-77

Esophageal

43-89

Gastric

4-33

Glioma

40-63

Head and neck

80-100

Ovarian

35-70

Pancreatic

30-89

Renal cell

50-90

Non-small-cell-lung

40-80

Obitelj receptora epidermalnog čimbenika rasta u ljudi EGF, TGFa , b Cellulin Amphiregulin, HB-EGF

No specific ligands often acts as dimer partner

TK

TK

erbB1 HER1 EGFR

erbB2 HER2 neu

Heregulins

NRG2 NRG3 Heregulins β-cellulin

TK erbB3 HER3

erbB4 HER4

EGFR struktura Izvanstanična domena

Transmembranska domena

TK

Unutarstanična domena

EGF receptor 



 

EGF receptor-funkcionira kao tirozin kinaza  Citoplazmatska domena ima slijed sličan src proteinu, sugerira da EGF djeluje kao tirozin kinaza Promjena EGF može funkcionirati kao onkoprotein  EGFsadrži slijed kao onkoprotein koji kodira erbB onkogen od (AEV virusa, avian erythroblastosis virus ) Onkogeni transmembranski receptor neovisan o ligandu (točkasta mutacija ili truncation-isjecanje, skraćenje) Fuzioniranje gena uzrokuje konstitutivnu dimerizaciju receptora-ligand neovisnu

EGFR Stimulation & dimerisation

TK

TK

TK

TK

EGFR Homo dimerizacija erbB1 HER1 EGFR

erbB2 HER2 neu

erbB3 HER3

erbB4 HER4

EGFR stimulation cont…

TK

TK

Hetero Dimerizacija erbB1 erbB2 HER1 HER2 EGFR neu

Rizik za rak

TK

erbB3 HER3

erbB4 HER4

EGFR- Funkcija u normalnim stanicama

ATP

TK

TK

ATP

+ Genska transkripcija

Stanična proliferacija

Progresija staničnog ciklusa Angiogeneneza

Antiapoptoza

EGFR signalni prijenos u stanicama tumora

TK

TK PI3-K

pY

pY

GRB2

pY

SOS RAS RAF

STAT3 PTEN

AKT MEK

Genska transkripcija

G1 M Proliferacijko/ sazrijevanje kemoterapija / radioterapija rezistancija

MAPK

S G2 Angiogeneza

Preživljavanje (anti-apoptoza) Metastaze

Steroidni hormon

Drugi mehanizmi stimulacije EGFR

MMP

HB-EGF

+ Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF)

α

P

γ β G protein

+ Ca++

Pyk2

P

+

Ras

Src MAPK

Transcription erbB Ligand Gene

Steroid hormone receptor

Kako se EGFR varianta razlikuje od divljeg tipa EGFR - Varianta III

EGFR –divlji tip

Nema izvanstanične domene

nazočna

Ligand ne može vezati

Može vezati

TK konstitutivno aktivna

TK aktivirana vezanjem liganda

Ne može stvarati dimere

može stvarati dimere

Nije nazočna u normalnim stanicama

nazočna u normalnim stanicama Prekomjerna ekspresija vodi raku

Veća sklonost za rak

ATP

TK

Genska transkripcija Progresija staničnog ciklusa

Stanična proliferacija

Metastaze Anti Apoptosis Rak

Mutacija

Posljedica proliferacije EGFR receptora

Normalna stanica Poremećaj regulacije

Stanica raka

EGFR-dobar cilj za karcinom pluća 

Visoka razina ekspresije receptora u usporedbi sa zdravim tkivom. EGFR - ključnu ulogu u rastu i funkcije tumorskih stanica. EGFR inhibicija može spriječiti nizvodno aktivnosti. EGFR inhibitori nemaju tešku toksičnost.

Obrazloženje za inhibitore EGFR u karcinomu glave i vrta 

 



EGFR izražen u > 90% slučajeva raka glave i vrata. Prekomjerna ekspresija EGFR povezana sa smanjenim preživljavanjem. povećanje EGFR je rani događaj u karcinogenezi i prisutan je još u premalignim lezijama. Inhibicija EGFR - TK usporava rast tumorskih ksenograft modela glave i vrata.

Anti-ligand EGFR tyrosine Anti-EGFR mAbs mAbs kinase inhibitors

ATP

TK

-

TK

TK

-

-

Bispecific Abs

TK

-

Immune effector cell

Strategija inhibicije EGFR signalizacije

Dostupni lijekovi Gefitinib Erlotinib

Visoko selektivan, potentni i reverzibilan EGFR tirozin kinaze inhibitor

Cetuximab – Monoklonalna Anti EGFR protutijela H 447 MDX 210

Bispecifična Anti EGFR protutijela Povezana sa anti CD 64

Indikacije Gefitinib & Erlotinib: Monoterapija u uznapredovalom stadiju NSCLC

Cetuximab Metastatski rak debelog crijeva s / bez irinotekana

Doze Gefitinib 250 mg O.D. oral Erlotinib 150 mg O.D. oral Cetuximab 400 mg/ m2 i.v.→ 200 mg / m2 i.v. wkly

Popratni učinci osip kože Proljev (EGFR - TKI s) Groznica (EGFR - mAb) Intersticijska bolest pluća - 1% (samo za gefitinib)

Prekidi zbog nuspojava su vrlo niski za razliku od kemoterapije

Međureakcija lijeka EGFR - TK inhibitori metaboliziraju se preko CYP3A4. Inhibitori / induktori CYP3A4 mogu promijeniti razinu lijeka. Varfarin interakcije su se dogodile u kliničkim ispitivanjima s gefitinib. Istovremena primjena s varfarinom zahtijeva praćenje PV, INR.

Prednosti inhibitora EGFR oralno učinkoviti Bolja kvaliteta života. Može se koristiti kao monoterapija. Nema potrebe za premedikacijama ili praćenja doze. Nema hematološke toksičnosti. Potencijal za dugotrajno liječenje. Smanjena otpornost na zračenje ili hormonsku terapiju

Molekularne značajke raka Mutacije u molekularnim signalnim putovima vode do:

• samodostatnosti čimbenika rasta (ligandi ili receptori) • Gubitak odgovor na anti-proliferativne signale • Izbjegavanje programirane smrti stanica • Povećanje replikativnog potencijala (telomere) • Promocija tkivne invazije i metastaziranja • Trajna angiogeneza • Pojačan abnormalnosti u DNA popravaku i genomskoj nestabilnosti

Ser / Thr kinaze (AKT, mTOR)

Onkogeni Delecijom domene (EGFRvIII, HER2

Lipidne kinaze (PI-3K) Transkripcijski faktori (cmyc, statistika, c-Jun, cFOS) Ciklini / CDKs (Ciklin D)

Regulatori stabilnosti proteina (MDM2) Antiapoptotski faktori (bcl-2, bcl-XL)

Onkogenu funkciju dobivaju

Mutacije onkogena su „pokretač" nastanka tumora

Receptor / citoplazmatski tirozin-kinaze (EGFR, PDGFR, Ras / MAPK)

Točka mutacija (ras)

Translokacija (BCRABL, Myc)

Izmijenjena substaničnog položaja (BCR-ABL) Genska amplifikacija (Myc, EGFR, Her2)

Onkogene mutacije u karcinomu H-Ras K-Ras N-Ras Neu EGFR

Increased expression Myc K-Ras Myb RelA EGFR

int-1 int-2 mos

Altered protein

Amplification

Point mutation

Insertion

Protooncogene Translocation

Deletion Normal protein

Altered Protein Abl, Trk

Increased expression C-Myc, Bcl-2

Altered protein EGFR, (ERB-B1), NF-B

Philadelphia Chromosome

Bcr (160KDa) (Breakpoint cluster region)

OLI

Abl (140KDa) Bcr-Abl ALL (190KDa) CML (210KDa/230 KDa)

OLI

Nowell and Hungerford (1960) t(9;22)(q34;q11) CML - 95% ALL, 25-30% in adult and 2-10% in pediatrics Abnormal signaling and localization

JAK1/2

Crk-L Grb2 PI-3 kinase Sos

Akt

STAT3 STAT5

Ras ERK1/2

Cyclin D1,D2,D3 Bcl-xL

Imatinib/Gleevec/STI571

Dasatinib

Druker, Sawyers i Talpaz pokazali da Gleevec inhibira proliferaciju CML Inhibiraju Abl vezanjem na ATP-vezno mjesto u domeni kinaza Recidiv kao rezultat leukemijskih subklonova s rezistentnim BCR-ABL mutacijama - tretiranje sa dasatinib

Dasatinib je oralni lijek, inhibitor BCR / ABL i src tirozin kinaze obitelji kod kronične mijeloične leukemije (CML) i Philadelphia kromosoma-pozitivni akutne limfoblastične leukemije (Ph + ALL) a procjenjuje se za upotrebu u brojnim drugim vrstama raka, uključujući i uznapredovali rak prostate.

Myc-inducirana onkogeneza 1

MB I

MB II

143

355 366

Myc

407 413

HLH

Transactivation Domains

LZ

DNA Binding and oligomerization 1

MB= Myc Boxes BR= Basic Region

HLH= Helix-Loop-Helix LZ= Leucine Zipper

434

Max

151

HLH

LZ

Mehanizmi onkogene aktivacije • 70% karcinoma ima promjene u Myc • Kromosomske translokacije -povećavaju c-myc transkripciju (Burkittov limfom, mišji plazmocitom i drugi limfoidnih malignih bolesti) • Amplifikacije gena (AML, pluća, dojke, debelog crijeva, mozga, prostate) • Točkaste mutacije povećanje transaktivacije funkcije (karcinom dojke, jajnika, debelog crijeva) • Aktivacija virusnim promotorom -B stanični limfom ptica-inducirani ptičjim leukemogenim virusom (engl.Avian leukemia virus, ALV)

C-myc Translocations in Cancer C-Myc gene

,l,m loci P1 P2 t(8;14) J Ei

P1

Cm

Ca1

P2 t(2;8) MAREi C Translocation

P1

P2 t(8;22) Cl

El

• Translokacije gen c-myc u području transkripcijski aktivne DNA • To povećava c-myc ekspresijsku razinu i uzrokuje neprirodnu proliferaciju Za razliku bcr-abl, c-myc translokacije ne mijenjaju strukturu proteina; povećava razinu ekspresije gena i proteina WT

C-Myc translokacije i bolesti Translocation

Genes

Disease

t(8;14)(q24;q32)

c-myc/IgH

Burkitt’s lymphoma

t(2;8)(p12;q24)

Ig/c-myc

Burkitt’s lymphoma

t(8;22)(q24;q11)

c-myc/Igl

Burkitt’s lymphoma

t(8;14)(q24;q32)

c-myc/IgH

Diffuse large cell lymphoma

t(8;14)(q24;q11)

c-myc/TCRa,b

t(8;14)(q24;q32)

c-myc/IgH

Multiple myeloma

t(2;8)(p12;q24)

Ig/c-myc

Multiple myeloma

t(8;22)(q24;q11)

c-myc/Igl

Multiple myeloma

T-cell acute lymphoblastic leukemia

Ras Oncogenic Mutations EGFR

sos

Grb2

GDP

P

Tethers Ras to membrane

P

Farnesyl

sos GTP

x P

Transferase

Ras Raf-1 MEK

ERK1

1

32 GTP binding

ED

GTP binding

GTPase

192

Inhibitors

HVR

ERK1 ERK2 MEK

ERK2 G12V

• • • •

Src

40

Q61L

CAAX Box (prenylation)

Jedan od najčešće mutiranih gena G12V i Q61L su uključeni u GTP vezivanje Obadvije mutacije stabiliziraju GTP-vezu stvarajući Ras Oboje resultira u konstitutivnoj aktivaciji MAPK signala

Ras Mutations in Human Tumors Cancer or site of tumor

*K=Kirsten; H=Harvey; N=neuroblastoma Mutation frequency %

Non-small-cell lung cancer (adenocarcinoma)33 Colorectal 44 Pancreas 90 Thyroid 53 Follicular 60 Undifferentiated papillary 0 Papillary 43 Seminoma 13 Melanoma 10 Bladder 30 Liver 10 Kidney 40 Myelodyplastic syndrome Acute myelogenous leukemia 30

Predominant Ras isoform* K K K H,K,N H,K,N K,N N H N H N,K N

Tumor supresor geni Tumor

supresorski geni su "kočnice" koji štite stanice od karcinogeneze -A.G. Knudson prvi dao pretpostavke za Retinoblastoma (Rb) koji loss of both alleles is required for loss of function. This is true for most but not all Ts genes.

• nasljedan -Maksimum 6 mjeseci starosti -Oba oka -heterozigotna +/-Drugi rak 36% kumulativnog rizika na 50 god starosti

• Ne-nasljedan -Maksimumima na 2 godine - Jedno oko pogođen -homozigot + / + -Drugi rak 6% kumulativnog rizika na 50 god starosti

Fosfataze (npr. PTEN) Faktori transkripcije / represori (p53) Popravak gena (BRCA1 / 2, MSH)

Inhibitori staničnog ciklusa (Rb) Regulatori stabilnosti proteina (c-CBL) Induktore apoptoze

(Bax, Bad)

Gubitaak funkcije vodi

Gubitak funkcije mutacijama uključuje gene koji kodiraju:

Tumor supresor geni Nedostatak u zastoju staničnog ciklusa smanjenju apoptoze

povećanju metastaza

PTEN tumor supresor gen Genske mutacije Glioblastoma Gastric Melanoma NHL Breast Prostate Endometrium Ovary Lung Bladder

25-75% 28% 20-30% 10% 15% 30% 40-80% 5% 22%

Genska metilacija Glioblastoma Colorectal Invasive Breast Melanoma Thyroid Endometrium Prostate

35% 8% 48% 62% 50% 20% 50%

10%

PTEN mutacije su povezane: • Rak (npr COWDEN sindrom), invazivnost, metastaze • otpornost na Herceptina, vinkristin, adriamicin, 5-fluourouracil cisplatina

PTEN 

PTEN protein je fosfataza koja djeluje na fosfatidilinozitol 3,4,5 trifosfat (PIP3), ključnu komponenta kontrole rasta koja stimulira proliferaciju a suprimira apoptozu; PTEN negativno regulira unutarstaničnu razinu fosfatidilinozitol3,4,5-trifosfata u stanici i djeluje kao tumor supresor negativno regulirajući AKT / PKB signalni put.



Prekomjerna ekspresija PTEN inhibira staničnu migraciju, širenje, fokalnu adheziju.

Glucose Amino acids

EGFR

GLUT1

Mutant Ras

sos

Grb2

GDP

P

PIP2

P

P

P

SH2

P

PI-3K

SH2

P110

x

Glucose

PH P

Akt

PTEN

PKA Glucose-6-P

sos GTP

PIP3

SH3

Ras

PIP2

PIP3

LKB1 Glycolysis

Raf-1 Src

AMPK

MEK ERK1

ERK2

MAPK/ERK signaling

P

P

P

MDM2

NF-kB

BAD

P

FKHD

P

P

GSK3b

mTOR

p27 FasL

p53

SH2 SH3 PH

binds phosphotyrosine residues binds proline-rich sequences binds lipid ligands (products of PI-3K)

cell death/survival cell cycle arrest/progression DNA repair/misrepair

cell metabolism

rapamycin

Retinoblastoma Gene Mutations in Cancer Retinoblastoma 70% Small Cell Lung Carcinoma 80% Non-Small Cell Lung Carcinoma 20-30% Osteosarcoma >50% Multiple Myeloma 30% Mitogens

Sherr (2000) Cancer Research 60:3689-3695

Cyclin D CDK 4/6 Rb P P P

E2F Rb S phase entry

+

E2F

CDK 2 Cyclin E E2F Cyclin E

Cyclin E gene

TP53 (p53)       

Transkripcjski faktor koji se veže na DNA DSBs Degradiran vezivanjem mdm2 Mutatiran u >50% karcinoma ljudi u DNA veznoj domeni Aktivira se preko IR kroz ATM, DNA-PK, etc. povećanje p21 (zastoj staničnog ciklusa) i Bax (apoptoza) ekspresije TP53 -/- miševi su osjetljivi na oštećenja DNA i imaju visoku pojavnost tumora TP53 mutirani tumori su više agresivni i više radiorezistentni P53 protein 1

50 TAD MDM2

Ser33 Ser15 ATM Ser20 ATR ATM ATR Chk1 Chk2

102

292

323

DNA binding

363

356 TET

393 CTR

Ser376

Ser37 DNA-PK ATR

Ser392

Phosphorylation sites

Decreased MDM2 binding

Increased transcriptional activation 1

108

p53 binding I

MDM2 nls

237

260 289

II

333

Ser395 III IV ATM (inhibition of p53 nuclear export)

489

Više mutacija potrebno za onkogenezu   



Prijenos jednog onkogen na normalne stanice obično nije dovoljna da ga preobrazi Gubitak jednog alela TS gena nedovoljan Rak učestalost raste s dobi, što ukazuje da je transformaciju stanica zahtijeva nakupljanje višestrukih mutacija Većina onkogena mogu izazvati i rast i apoptozu, što ukazuje da je transformacija zahtijeva jednu mutaciju koja povećava rast stanica, a drugi da inhibira staničnu smrt (onkogen "suradnje").



Primjeri "dva hit" gena parova u tumorima: Ras / P16 BRCA1 / p53 p27 / RB Myc / P53 Myc / Ras

Onkogena kooperacija (valjanost "dva pogotka" hipoteze) Ekspresija samo c-myc ili ras nedostatna za transformaciju stanice

C-myc

Ras

P16

P19 Arf p53

Apoptosis

Senescence

Transformed focus

Ekspresija c-myc i ras zajedno vodi transformaciji

A Multi-step Process in Colorectal Cancer

Normal Epithelium

APC(adenomatous polyposis coli)/b-catenin

Small Adenoma

Increasing Genetic Instability

K-Ras/BRAF

Large Adenoma

SMAD4/TGF-bRII PI3K3CA/PTEN TP53/BAX

Carcinoma ?

Metastasis

Mmultiformni glioblastom Normal loss of 17p, TP53; PDGF-aR overexpression Grade II Loss of RB, 18q, 9p/IFN/p16; CDK4, MDM2 amplification Grade III EGFR amplification/mutation PDGF-a/b overexpression, loss of PTEN phosphatase on chr. 10 Grade IV GBM • Oko 40% glioblastoma pokazuju amplifikaciju genskog lokusa EGFR i oko polovine eksprimiraju mutantni EGFRvIII receptor koji je konstitutivno aktivan zbog skraćivanja izvanstanične ligand-vezujuće domene. EGFRvIII povećava rezistenciju na zračenje 15-20% glioblastoma pacijenata reagira na niskomolekularne inhibitore EGFR kinaza, ali samo ako su netaknute PTEN fosfataze. Inihibicija aktivnosti mTOR rapamicinom pomaže..

CIKLINI I KINAZE OVISNE O CIKLINIMA- skupine dioboupravnih bjelančevina

Ciklini i kinaze ovisne o ciklinimaskupine dioboupravnih bjelančevina 

Ciklini i kinaze ovisne o ciklinima (engl. Cvcline Dependent Kinase, CDK) su važne skupine dioboupravnih bjelančevina čiji izražaj i trenutna koncentracija upravlja umnažanjem DNA i diobom stanice.



CDK su molekule relativne molekulske mase 35-40 kD, ciklini oko 60 kD

Regulacija staničnog ciklusa Trajanje staničnog ciklusa

Sat koji određuje vrijeme trajanja staničnog ciklusa Svaka faza se događa samo jednom i mora biti završena do kraja Susstav mora biti prilagodljiv Zaustavljanje staničnog ciklusa -ako predhodna faza nije dovršena -zbog oštećenja DNA ili -signala iz okoline

KONTROLA STANIČNOG CIKLUSA G2/M kontrolna

M kontrolna

točka

točka

M G2

G1 S G1/S kontrolna točka

G0



Kontrolne

Kontrolne točke

Ciklin ovisne kinaze i ciklini Ciklini Proteini odgovorni za redosljed pojedinih faza staničnog ciklusa

Osiguravaju da se svaka faza dogodi samo jednom

Imaju kinaznu aktivnost samo u kompleksu s ciklinima

Cdk (engl. cyclin depedent kinases) Imaju kinaznu aktivnost samo u kompleksu s ciklinima Fosforilraju (aktiviraju/inaktiviraju) ciljne proteine na serinu i treoninu što rezultira pokretanjem određene faze staničnog ciklusa Koncentracija u stanici konstantna ali se periodično mjenja tijekom staničnog ciklusa

Kontrolni sustav staničnog ciklusaproteinske kinaze ovisne o ciklinima i ciklini Proteinske kinaze ovisne o ciklinima





 

Fosforilliraju ciljne proteine na serinu i treoninu



Ciklini vežu se za Cdk molekule i kontroliraju njihovu sposobnost da fosfoliraju ciljne proteine Tijekom staničnog ciklusa ciklički se sintetiziraju i degradiraju Postoje: G1 ciklini i mitotički ciklini

Maturacijski promocijski faktor (MPF) –faktor poticanja sazrijevanja   

Kontrolira točku G2; regulira ulazak stanice u mitozu Kompleks mitotičkog ciklina i Cdk molekule Aktivirani MPF potiče:   



Kondezaciju kromosoma Raspad jezgrine ovojnice Reorganizaciju mikrotubula u diobeno vreteno

Za završetak mitotičke diobe potrebne fosfataze (uklanjaju fosforilizirana mjesta)

Srž staničnog kontrolnog sustava 



Cdk se vezuju s različitim ciklinima kako bi pokrenuli napredovanje staničnog ciklusa Aktivnost Cdk prestaje degradacijom ciklina

Ključni procesi koji potiču napredovanje staničnog ciklusa

Cikličko nastajanje ciklina i Cdk, aktivacija, razgradnja kompleksa ciklina i Cdk

Fosforilizacija ciljnih prfoteina

Aktivacija i inaktivacija ciklina 

Fizičkim vezivanjem ciklina i CDK molekulski sklop stječe enzimsku aktivnost, a disocijacijom sklopa CDK postaje inaktivna.



inhibitorne molekule CDK - ciklinskog sklopa, autofosforilacija, te dinamika sinteze i razgradnje ciklina i CDK putem ubikvitinizacije i proteasomske degradacije, određuju aktivnost tih dioboupravnih sklopova u staničnom ciklusu.



Aktivne kinaze, sklopovi CDK-ciklini fosforiliraju supstrate među kojima protein RB (pRB) predstavlja ključnu molekulsko-molekulsku sponu prema izravnim transkripcijskim čimbenicima u jezgri.



Stanični mehanizmi su ugođeni na neprestanu citoplazmatski čimbenici mogu modificirati ciklus

diobu

a

aktivni Rb

neaktivni fosforilirani Rb

P

P

neaktivni E2F ciljni gen

Go

aktivni E2F

transkripcija

ciljni gen

STANICA U DIOBI

Mutacija proteina RB, nema regulacije prelaza stanice iz G1 u S fazu (Retinoblastom)

pRB 

pRB je bjelančevina relativne molekulske mase 105 kD čiji gen je kod čovjeka smješten na 13q kromosomu.



U nefosforiliranom obliku pRB molekula čvrsto veže E2F transkripcijski čimbenik zbog čega on nedostaje u DNA-vezivnim transkripcijskim sklopovima.



E2F prijepisni čimbenik se pojavljuje kod čovjeka kao skupina molekula E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 i E2F5 koje djeluju u obliku heterodimera s partnerskom molekulom DP 1.



Vezno mjesto E2F molekule za pRB čine 18 aminokiselina na karboksi kraju proteina.



S druge strane, E2F prijepisni čimbenici izravno se vežu na DNA i to na specifični oktanukleotidni slijed TTTCGCGC, odnosno konsenzualni slijed.

Regulatorne molekule 





Regulatorne molekule pl5, pl6, p21, p27, p53, pl07, pl30 i RB potencijalna su mjesta poremećaja regulacije staničnog diobenog ciklusa. Odsutnost molekula, patogenetski povoljne mutacije ili kemijska modifikacija tih molekula kočenja rezultira otkočenjem staničnog ciklusa i pojavom nekontrolirane diobe. molekulske promjene koje utječu na izražaj i funkciju ovih regulacijskih sklopova mogu otkočiti sustav i dovesti do nekontrolirane diobe

Geni koji su uključeni u dioboupravne procese stanice sadrže jedan ili više oktanukleotidnih konsenzualnih slijedova za vezno mjesto E2F*

Shematski prikaz približnih vremena utjecaja pojedinih dioboupravnihmolekula u staničnom diobenom ciklusu. Gl/S i G2/M nadzorne točke (označene uspravnim isprekidanim linijama) su kritične dobe staničnog ciklusa na kojima se ciklus zaustavlja pri pojačanju signala kočenja. Pri otkočenju molekulski signali pobude nesmetano i spontano vode stanični ciklus kroz diobe: Cl:CDK=cycline dependent kinase, kinaza ovisna o ciklinima, to jest kinaza kojoj je fizičko vezivanje ciklina neophodan preduvjet za funkcioniranje.)



Shematski prikaz molekulskih putova koji određuju aktivnost staničnog ciklusa. Proteini pl5, pl6, p21 i p27 su inhibitori CDK-ciklinskih kinaznih kompleksa, čime se smanjeno fosforilira RB i pojačano veže E2F što koči stanični ciklus. Proteini pl07 i pl30 izravno koče E2F i stanični ciklus. Simbol "(—)" označava kočenje, a simbol "(+)" pobudu čimbenika iza strelice čimbenikom ispred strelice. Simbol "(+P)" označava fosforilaciju čimbenika iza strelice.

Proteini pl5, pl6, p21 i p27 su inhibitori CDK-ciklinskih kinaznih kompleksa, čime se smanjeno fosforilira RB i pojačano veže E2F što koči stanični ciklus.

UČINAK NA DIOBENI STATUS STANICE REZULTAT JE ODNOSA FOSFORILIRANOG I DEFOSFORILIRANOG RB-PROTEINA: 

POBUDA: Hiperfosforiliranjem RB smanjuje se nefosforilirani RB čime se oslobađa E2F, koji oblikuje s drugim jezgrinim čimbenicima ključne DNA-vezivne sklopove što pokreće diobu.



KOČENJE: Smanjenom fosforilacijom RB povećava se vezivanje E2F, što uzrokuje prestanak diobe, budući da se raspadaju ključni DNA vezivni polimerni sklopovi.

Ciklin D–CDK4, ciklin D– CDK6, i ciklin E–CDK2 reguliraju prijelaz G1-do-S faze pomoću fosforilacije RB proteina (pRB). Ciklin A–CDK2 i ciklin A– CDK1 su aktivni u S fazi. Ciklin B–CDK1 je bitan za G2-do-M prijelaz. Dvije familije CDKIs mogu blokirati aktivnost CDKs i progresiju tkroz stanični ciklus. INK4 inhibitori (p16, p15, p18, i p19) djeluju na c ciklin D–CDK6. Drugi (p21, p27, i p57) mogu inhibirati sve CDKs.

Protoonkogeni

Tumorsupresor geni

Mutacije onkogeni Gubitak obadva alela

Onkogeni proteini

Protein kinaze

Ciklini

Stanični ciklus G1 - S faza

TP53

Oštećenje DNA zaustavlja stanični ciklus

p53

WAF1

-P53 aktivira transkripciju M G2

p21 G1

S

p21 (inhibitor CdK-4-ciklin D), aktivira gene uključene u popravak i pokreće apoptozu -mutacija p53, vodi nagomilavanju muacija (genske i kromosomske) i nastanku tumora

p21 inhibira ciklin/ciklinovisne kinaze