Endofity bakteryjne

„Obecność endofitów w tkankach roślin a odporność na patogeny korzeniowe” dr Katarzyna Kubiak, mgr inż. Miłosz Tkaczyk, dr hab. Tomasz Oszako, Marta Siebyła Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary 8.10.2013

Plants are full of microbes!!!!!!! Rośliny pozbawione mikroorganizmów stanowią wyjątki – (doświadczalne), rośliny zawierające mikroorganizmy są regułą w naturze.

Fenotyp rośliny w naturze jest produktem ewolucyjnie wykształconej regulacji ekspresji genów roślinnych i bakteryjnych, dlatego większość roślin reprezentuje tzw. „ rozszerzony fenotyp” (“extended phenotype” według Dawkins (1999)).

Mikroorganizmy które kształtują „rozszerzony fenotyp” roślin to mikroorganizmy: • Patogeny • Symbionty (mutualizm ++, komensalizm +0) • Epifity • Endofity (kolonizacja roślin wewnątrz komórek lub w przestworach międzykomórkowych nie powodując szkód w organizmie roślin)

Endofit oznacza = “endo” (wewnątrz) + “phyte” (roślina) Po raz pierwszy endofity zostały zdefiniowane jako mikroorganizmy (grzyby=Fungi)żyjące wewnątrz organizmu rośliny (Wilson, 1995).

Neotyphodium spp. są często związane z kostrzewą trzcinową w tkankach liści. Grzyb ten produkuje metabolity wtórne toksyczne dla zwierząt roślinożernych. http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/

Roots of Rare Wild Rice (Oryza granulate) from a Nature Reserve in Yunnan, China

Grzyby i bakterie są najpowszechniejszymi endofitami roślin.

http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full

Endofity zasiedlają całą roślinę - ZDROWĄ !!!!

http://www.frontiersin.org/plant-microbe_interaction/10.3389/fpls.2011.00100/full

Endofity roślinne - Normalny Fenotyp rośliny- rośliny zdrowe (lewa rycina) Endofity grzybowe liści (A), Endofity bakteryjne liści (B), Rhizobia (C), Grzyby mikoryzowe (mikoryza arbuskularna) (D).

Endofity silnie wpływają na witalność rośliny, rośliny pozbawione endofitów (prawa rycina) chorują (chlorozy, niska efektywność fotosyntezy, niska odporność na stresy i szkodniki) i często w naturze nie są w stanie przeżyć.

Pierwotnie, Endofity zostały zdefiniowane przez Wilson (1995) jako “fungi that are present in host plant tissues, during at least part of their life cycle, without causing visible symptoms.” Badania na temat endofitów powstałe w ostatniej dekadzie wskazują że definicja ta posiada wady:

1. Mikroorganizmy rezydujące w roślinie niepowodujące szkód to nie tylko grzyby mikroskopowe ale także bakterie oraz „wirusy” 2. Efekt „infekcji” mikroorganizmów w roślinie gospodarza jest warunkowy i może przechodzić od mutualizmu do antagonizmu (każdego rodzaju interakcji pomiędzy mikroorganizmami a roślinami), 3. Klasyczne endofity wprawdzie nie powoduje widocznych objawów chorobowych, to mają wpływ na fenotyp rośliny: rośliny wolne od endofitów wyglądają i funkcjonują inaczej od tego samego gatunku rośliny z endofitami.

Endofity bakteryjne "bakterie endofityczne" jest to termin odnoszący się do bakterii, które kolonizują wnętrze części roślin: wnętrze korzeni, łodygi, liści lub nasion, nie powodując żadnego szkodliwego wpływu na roślinę-gospodarza (Hallmann et al., 1997).

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte http://aobblog.com/2013/05/what-bacteria-are-in-your-banana/

Endofityczne bakterie w roslinie - Medicago sativa, lucerne. .

Endofityczne bakterie w roślinie Musa sp, banan.

Pochodzenie i rola endofitów w roślinie Większość endofitów pochodzi z ryzosfery lub fylosfery, jednak niektóre z nich mogą być przekazywane za pośrednictwem nasion (Ryan i in., 2007). Fylosfera = nadziemne części roślin będąca miejscem bytowania mikroorganizmów. Ryzosfera = strefa korzeniowa będąca miejscem bytowania mikroorganizmów.

1. Bakterie te mogą promować kiełkowanie i wzrost roślin, przyrost biomasy, powierzchni liści (przem. spożywczy, energetyczny) 2. Bakterie mogą indukować ogólnoustrojową tolerancję roślin w odpowiedzi na biotyczne lub abiotyczne stresy roślin (fitoremediacja), 3. Bakterie mogą indukować odporności przeciwko patogenom (BIOKONTROLA).

Interakcja bakteria – gospodarz „host” 1. Endofityczne bakterie żyjące w tkankach roślin mogą być obligatoryjnymi lub fakultatywnymi m-org.

2. Niektóre bakterie endofityczne mogą kolonizować tysiące gatunków roślin, podczas gdy niektóre są dedykowane do określonych rodzin roślinnych (Endofity są organizmami niszowymi).

3. Każdy gatunek rośliny jest gospodarzem jednego lub więcej endofitów (Ryan i in. 2007), zazwyczaj jeden lub dwa gatunki endofitów dominują w określonym „hoście”, (Bernardi-Wenzel i in., 2010).

Endofity – ochrona rośliny przed infekcjami patogenów korzeni Ochrona pośrednia – przez stymulacje wzrostu: 1. Wiązanie N – produkcja białek (np. chlorofil) 2. Produkcja fitohormonów (auksyny, cytokininy, gibereliny) 3. Hamowanie biosyntezy etylenu (h. starzenia), 4. Stymulacja rozwoju bakterii wiążących azot (koinokulacji soi Bradyrhizobium japonicum i Pseudomonas fluorescens) 5. Stymulacja ” infekcji” grzybami mikoryzowymi ( pobierania wody z solami,  akumulacji cukrów, lipidów (inokulacja Azotobacter diazotrophicus – ziemniaki –  grzyb Glomus clarum) 6. Wytwarzanie specyficznych związków - sideroforów

Ochrona bezpośrednia – przez działania antagonistyczne: 1. Wytwarzanie specyficznych związków • np. sideroforów ( powinowactwo do Fe niż patogeny, przez co hamują ich rozwój); • kwasu cyjanowodorowego w zasiedlonej tkance korzeniowej roślin, ograniczającego rozwój patogenicznych grzybów; • ochronne biopolimery lub glikoproteiny ( bariery ochronnej przed patogenami lignifikacja ścian komórkowych np. jako mechanizm oporności na np. Colletotrichum ściany komórkowe tkanki ogórka); 2. Podnoszenie w środowisku stężenia Fe – stężenie toksyczne dla patogenów - fluoryzujący Pseudomonas hamuje rozwój patogenów Fusarium oxysporum (korzen) i Erwinia carotovora (korzeń, liść); 3. Endofity silnie namnażają się w miejscu zaatakowanym przez patogeny –konkurują z patogenem o wodę i skł. pokarmowe (Bacillus macerans – patogeny Botrytis cinerea i Botrytis fabae) 4. Produkcja antybiotyków (Pseudomonas putida - fenazynę - chroniącą ziemniaki przed miękką zgnilizną korzenia, wywołaną przez Erwinia carotovora) 5. Produkcja enzymów litycznych (Serratia marcescens i Paenibacillus sp. wydzielają chitynazę wykazującą wywierać aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko Fusarium oxysporum; Bacillus cepacia poprzez produkcję β -1 3-glukanazy niszczy Rhizoctonia solani, Rhizobium. rolfsii i przez Pythium ultimum)

Endofity korzeniowe wiążące azot atmosferyczny Rola ekologiczna i ekonomiczna endofitycznych bakterii wiążących azot (bakterie brodawkowe) w komórkach korzeni roślin motylkowych (bobowatych-Fabaceae), jest dobrze poznana.

Gorczyca Sinapis alba –poplon, międzyplon Pisum sativum groch – r straczkowa

Każda roślina może współżyć tylko z określonym gatunkiem bakterii brodawkowych, np.: łubin współżyje z Bradyrhizobium. sp., soja – Bradyrhizobium japonicum, groch, bób i soczewica – Rhizobium. leguminosarum bv. viceae, fasola – R. leguminosarum bv. phaseoli, koniczyna – R. leguminosarum bv. trifolii.

Peluszka Pisum arvens-r.pastewna, miedzyplon

Kwiatostan Trifolium hybridum – r. pastewna

U roślin motylkowych bakterie z rodzaju Rhizobium i Bradyrhizobium stymulują komórki korzenia do wytwarzania brodawek korzeniowych-NODULACJA. Do brodawek bakterie przedostają się z gleby, tam się aklimatyzują, tworzą odpowiednie enzymy i warunki dla tych enzymów w komórkach roślinnych aby efektywnie wiązać azot N2 do N – amonowego i eksportowany do organów nadziemnych . Nodulacja Rhizobium w glebie, G-

Brodawka korzeniowa

Rhizobium bakteroid

Rola ekonomiczna- Endofity wspomagają rozwój roślin o znaczeniu spożywczym oraz energetycznym W innych roślinach (niż motylkowe) wykryto obecność endofitów korzeniowych wiążących azot atmosferyczny np. trzcina cukrowa (przemysł spożywczy). • Rośliny motylkowe : do 550 kg N/ha/rok) (Gabryś, 2002) • Trzcina cukrowa: do 150 kg N/ha/rok (Baldani, 2000). Wiązanie azotu za pomocą endofitów ma miejsce także w korzeniach ryżu, kukurydzy (przem. spożywczy) ale także uprawa roślin - biopaliw – np. Miscanthus i inne trawy (przemysł energentyczny)

Saccharum officinarum trzcina cukrowa

Miscanthus giganteus

Metodyka

Wybór prób

Sterylizacja: alkohol 70% - 3 min.; podchloryn sodu 2,5% - 5 min.; alkohol 70%- 30 sek. i 5x woda sterylna

Fragmentacja 5x5 mm; wyłożenie na podłoża stałe – Obliczenie CR

Reizolowanie kultur bakteryjnych

Identyfikacja gatunkowa bakterii wykazujących antagonizm w stosunku do patogenów korzeniowych (analiza DNA i sekwencjonowanie) Testy antagonizmu: F .solani i B. amyloliquefaciens (etap kolejny)

Uzyskanie czystych kultur – posiew redukcyjny

Wyniki :Testy antagonizmu: endofit-patogen korzeniowy

Analiza filogenetyczna – ML (program CLC) (dane z BLAST NCBI stopień homologii w %)

Wyniki

•

Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506 Dekompozycja efektywnych hipotez Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności 0,35

0,30

0,25

CR

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 kontrola

Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone

zabieg

Nadleśnictwo Piaski Nadleśnictwo Krotoszyn

Wariant

Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506 Dekompozycja efektywnych hipotez Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności 0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00 Piaski

Krotoszyn Nadleśnictwo

Kontrola Zabieg

Nadleśnictwo*Wariant; Średnie nieważone Bieżący efekt: F(1, 76)=2,6909, p=,10506 Dekompozycja efektywnych hipotez

Nadleśnictwo ; Średnie nieważone

Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności

Bieżący efekt: F(1, 50)=1,0590, p=,30839

0,35

Dekompozycja efektywnych hipotez Pionowe słupki oznaczają 0,95 przedziały ufności 0,30

0,30

0,28 0,26

0,25

0,24 0,22

0,20 CR

•

Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn, Piaski, Karczma Borowa z powierzchni kontrolnych i testowych Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il. fragm. „kiełkujących”/ogólna il. fragm. Analiza wpływu Nadl.*wariant (ANOVA, 2 –czynnikowa; Statistica 8.0)

CR

•

0,20 0,18

0,15

0,16

0,10

0,14 0,12

0,05

0,10 0,08

0,00

0,06 Karczma Borowa

Krotoszyn Nadleśnictwo

Piaski

Krotoszyn Nadleśnictwo

Wariant kontrola Wariant zabieg

• Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn, Piaski z powierzchni kontrolnych i testowych • Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il. fragm. „kiełkujacych”/ogólna il. fragm. • Analiza korelacji CR a defoliacja, witalność, syntetyczny wskaźnik uszkodzeń drzewostanów (SYN) CR = 0,2906-0,0906*x; 0,95 Prz.Ufn.

CR = 0,251-0,002*x; 0,95 Prz.Ufn.

0,35

0,35

0,30

0,30

0,25

0,25

0,20 CR

CR

0,20

0,15

0,15

0,10

0,10

0,05

0,05

0,00 20

30

40

50

60

70

80

Defoliacja [%]

90

100

0,00 0,8

110

Wielo Skory Wielo SS - df - MS - SS - df - MS kr. - gow kr. - R Model Model Model Reszta Reszta Reszta R2 R2

4395, 8469, 17 848 309

1,2

1,4

1,6

F

1,8

2,0

2,2

Syn

95% p.ufności

Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity)

Defoli 0,584 0,341 0,302 4395, acja 1 539 686 962 848 [%]

1,0

2,4

2,6

2,8

95% p.ufności

Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity) Wielo Skory Wielo SS - df - MS - SS - df - MS kr. - gow kr. - R Model Model Model Reszta Reszta Reszta R2 R2

p

498,1 8,823 0,008 947 556 578

Syn

0,498 0,248 0,204 1,113 1 870 871 687 387

1,113 3,360 17 387 363

F

p

0,197 5,632 0,029 668 602 684

Literatura • • • • • • • • • • • • • • •

• • •

Hallmann J, Quadt- Hallmann QA, Mahaffee WF and Kloepper JW (1997). Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol. 43:895–914. Jha, P.N., Gupta, G., Jha P., Mehrotra, R. (2013). Association of rhizospheric/endophytic bacteria with plants: A potential gateway to sustainable agriculture. Greener J Agri. Sci. 3:73-84. Backman PA and Sikora RA (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biol. Control. 46: 1– 3. Chu H, Fujii T, Morimoto S, Lin X, Yagi K, Hu J, Zhang J (2007) Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral fertilizer and organic manure in a sandy loam soil. Appl Environ Microb 73:485–491 Seghers, D., E. M. Top, D. Reheul, R. Bulcke, P. Boeckx, W. Verstraete, and S. D. Siciliano. 2003. Long-term effects of mineral versus organic fertilizers on activity and structure of the methanotrophic community in agricultural soils. Environ. Microbiol. 10:867-877. Dawkins, R. (1999). The Extended Phenotype. Oxford: Oxford University Press. De Deyn, G. B., Biere, A., Van Der Putten, W. H., Wagenaar, R., and Klironomos, J. N. (2009). Chemical defense, mycorrhizal colonization and growth responses in Plantago lanceolata L. Oecologia 160, 433–442. Baldani J.I., 2000. The sugarcane story – reasons for succes in Brazil. Proc. Int. Symp. on Nitrogen Fixation with non-legumes, Australia, 171. Gabryś Halina: Gospodarka azotowa W: Fizjologia roślin (red. Kopcewicz Jan, Lewak Stanisław). Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2002, s. 246259. Backman, P.A and Sikora, R.A. (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biological Control 46: 1-3. Wilson, D. (1995). Endophyte – the evolution of a term, and clarification of its use and definition. Oikos 73, 274–276. Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). Immunolocalization of dinitrogenase reductase produced by Klebsiella pneumoniae in association with Zea mays L. Applied and Environmental Microbiology, 66(2), 783-787

http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/ http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte