Indice - IRIS Università degli Studi di Firenze

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Indice 1. La barriera di filtrazione glomerulare

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1.1 Endotelio capillare fenestrato

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1.2 Membrana basale glomerulare

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1.3 Podociti

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1.4 Slit diaphragm: struttura e natura molecolare

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2. Il danno podocitario: glomerulosclerosi e sindrome nefrosica 2.1 Glomerulosclerosi focale e segmentale 2.1.1 Altri quadri istopatologici di podocitopatia

2.2 Sindrome nefrosica 2.2.1 Sindrome nefrosica steroido-resistente

12 14 15

16 17

3. Geni podocitari e sindrome nefrosica

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3.1 Fattori di trascrizione del podocita

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3.1.1 WT1

22

3.1.2 LMX1B

24

3.2 Componenti della slit diaphragm

25

3.2.1 NPHS1

25

3.2.2 NPHS2

26

3.2.3 CD2AP

27

3.2.4 TRPC6

27

3.3 Componenti del citoscheletro podocitario

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3.3.1 ACTN4

28

3.3.2 MYH9

28

3.3.3 INF2

29

3.4 Proteine citoplasmatiche e mitocondriali

29

3.4.1 PLCE1

30

3.4.2 SCARB2

30

3.4.3 COQ2, PDSS2 e MTTL1

31

3.5 Proteine della membrana basale glomerulare

31

3.6 PTPRO, MYO1E ed ITGA3

34

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4. Terapia della sindrome nefrosica e della glomerulosclerosi

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4.1 Terapia farmacologica

35

4.2 Rigenerazione glomerulare con cellule staminali

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5. Scopo della tesi

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6. Materiali e metodi

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6.1 Soggetti studiati

41

6.2 Estrazione del DNA

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6.3 Next Generation Sequencing

43

6.4 Targeted resequencing di 45 geni podocitari

43

6.4.1 Selezione dei geni ed array design

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6.4.2 Preparazione library di DNA ed amplificazione pre-capture

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6.4.3 Sequence capture del DNA genomico: ibridazione in fase liquida con tecnica NimbleGen

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6.4.4 emPCR: amplificazione clonale in emulsione

49

6.4.5 Sequenziamento con GS FLX Titanium 454 Roche

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6.4.6 Analisi dei dati

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6.4.7 Validazione varianti

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6.5 Array Comparative Genomic Hybridization 7. Risultati 7.1 Targeted resequencing di 45 geni podocitari 7.1.1 Analisi della Run di sequenziamento e della Sequence Capture 7.1.2 Interpretazione delle varianti geniche individuate 7.1.3 Genotipo e fenotipo clinico 7.1.4 Genotipo e risposta alla terapia farmacologica 7.1.5 Genotipo e quadro istopatologico della biopsia renale

56 58 58 58 61 72 72 73

8. Discussione

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Bibliografia

82

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Capitolo 1

La barriera di filtrazione glomerulare

I reni, destro e sinistro, sono organi escretori situati nella parete posteriore dell'addome, in posizione retroperitoneale; oltre alla funzione emuntoria, hanno un ruolo nella regolazione del bilancio idrico, dell'equilibrio elettrolitico ed acidobase ed una funzione endocrina, in quanto producono gli ormoni renina ed eritropoietina e partecipano alla sintesi della vitamina D. L'unità funzionale del rene è il nefrone; nell'uomo ogni rene contiene circa un milione di nefroni, ognuno dei quali è formato da un glomerulo capillare e da un tubulo. Il glomerulo renale consiste di un gruppo di capillari sostenuti da cellule mesangiali. L'intero glomerulo è racchiuso dalla capsula di Bowman, dove si raccoglie il liquido filtrato, che da qui passa nel tubulo renale. L'alta pressione idrostatica intracapillare filtra il sangue in preurina; il filtro glomerulare consiste nella barriera di filtrazione glomerulare (BFG) (Fig. 1.1), che si compone di tre strati: l'endotelio capillare fenestrato, la membrana basale glomerulare ed uno strato di cellule endoteliali, i podociti, che ricoprono la superficie esterna della membrana basale.1 L'ultrafiltrato glomerulare (preurina) è in media di 180 L/die; questo subisce, poi, un intenso processo di riassorbimento a livello del tubulo renale, per cui il volume urinario finale è ridotto a circa 1-1,5 L/die. Le molecole plasmatiche sono filtrate attraverso il glomerulo in base alla loro dimensione ed in base alla loro carica; molecole cariche negativamente o maggiori di 42 Å in diametro o di 200 kDa non vengono filtrate.

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Fig. 1.1 Barriera di filtrazione glomerulare. E' composta dall'endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti. I podociti hanno il loro corpo cellulare all'interno dello spazio urinario e si ancorano alla membrana basale glomerulare attraverso i processi pedicellari, i quali sono separati tra loro da pori di filtrazione, coperti da una struttura a ponte definita 'slit 24

diaphragm'. Immagine ripresa da Leeuwis JW et al. (2010).

1.1 Endotelio capillare fenestrato Le cellule endoteliali del glomerulo sono altamente fenestrate. Le fenestrae hanno un diametro di 70-100 nm e costituiscono il 20-25 % della superficie capillare del glomerulo. Il diametro delle fenestrae è relativamente grande rispetto a quello dell'albumina, proteina fisiologicamente trattenuta dal filtro glomerulare; l'endotelio capillare non sembra quindi contribuire alla filtrazione, dimensione-dipendente, delle molecole plasmatiche. Tuttavia queste cellule, sul versante luminale, sono ricoperte da un glicocalice costituito da glicoproteine cariche negativamente, glicosaminoglicani e proteoglicani associati alla membrana delle cellule endoteliali; l'endotelio capillare sembra quindi avere un ruolo di filtro selettivo in base alla carica delle molecole plasmatiche.2

1.2 Membrana basale glomerulare La membrana basale glomerulare (MBG) costituisce la struttura portante del glomerulo, cui le cellule endoteliali, da un lato, ed i podociti, dall'altro, si ancorano. E' costituita da una rete fibrosa, cui partecipano il collagene di tipo IV,

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laminine e proteoglicani. Il collagene di tipo IV è composto da catene α3, α4 e α5 e può essere considerato lo scheletro della membrana basale glomerulare: infatti mutazioni nei geni che codificano per il collagene di tipo IV causano la Sindrome di Alport, una malattia genetica che si manifesta con ematuria e progressivo decadimento della funzionalità renale.3 Le laminine sono proteine eterotrimeriche presenti in tutte le membrane basali, dove formano una rete con il collagene di tipo IV; nella MBG è soprattutto rappresentata la laminina-521, composta dalle catene α5, β2, γ1. L'importanza di questa laminina per il funzionamento del filtro glomerulare è testimoniata dal fatto che mutazioni nel gene LAMB2, che codifica per la laminina β2, causano una forma sindromica di sindrome nefrosica ad esordio precoce, nota come sindrome di Pierson.4

1.3 Podociti I podociti sono cellule altamente specializzate e differenziate, localizzate sul versante esterno della MBG. Hanno un voluminoso corpo cellulare che sporge nello spazio urinario; dal corpo cellulare partono delle lunghe proiezioni citoplasmatiche che si dividono in piccoli processi, chiamati processi pedicellari, i quali circondano la superficie esterna dei capillari. I processi pedicellari di podociti adiacenti si interdigitano tra loro in modo regolare, attraverso una giunzione cellulare specializzata detta slit diaphragm (SD), la quale copre a ponte i pori di filtrazione che separano un processo pedicellare dall'altro. Attraverso questi pori, coperti dalla SD, avviene la filtrazione del sangue in preurina.5 La SD divide la membrana plasmatica dei processi pedicellari in basale, apicale, e laterale (rappresentata dalla SD stessa). A livello citoplasmatico queste tre superfici sono interconnesse attraverso un citoscheletro di filamenti di actina.1 Nel corpo cellulare, il reticolo endoplasmatico ed l’apparato di Golgi sono ampiamente rappresentati; al contrario, i processi pedicellari contengono solo pochi organelli. La densità di organelli nel corpo cellulare è espressione dell'intensa attività anabolica e catabolica del podocita, il quale svolge un ruolo importantissimo nel supporto e mantenimento della BFG, oltre a sintetizzare la maggior parte dei componenti della MBG. 5 Altre funzioni podocitarie sono la

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cooperazione con le altre cellule glomerulari, quali le cellule endoteliali e le cellule mesangiali, ed un ruolo di sorveglianza immunologica verso patogeni e proteine anomale eventualmente presenti nello spazio di Bowman, attraverso l'espressione costitutiva di un recettore Toll-like di tipo 4.6 Sul versante basale i podociti aderiscono alla MBG attraverso recettori cellulari transmembrana, quali integrine, tetraspanine e destroglicani (Fig. 1.2). Le integrine sono proteine eterodimeriche costituite da una subunità α ed una β; nei podociti l'isoforma α3β1 è la più rappresentata. L'importanza di questa isoforma è testimoniata da esperimenti su topi knock-out per l'integrina α3, i quali mostrano difficoltà nello sviluppo del glomerulo capillare e su topi in cui l'espressione dell'integrina è soppressa durante lo sviluppo podocitario. Questi ultimi sviluppano una massiva proteinuria dopo la nascita e, al microscopio elettronico, i glomeruli mostrano una completa retrazione dei pedicelli.7 L'integrina α3β1 è il recettore della laminina521; l'alterazione di questo complesso porta perciò ad un indebolimento dell'adesione dei podociti alla MBG, causando il distaccamento dei podociti dalla stessa, e quindi proteinuria. Recentemente la tetraspanina CD151 è stata localizzata a livello dei processi pedicellari ed esperimenti su topi knock-out per CD151 hanno mostrato lo sviluppo di proteinuria in assenza di questa proteina.8

Fig. 1.2. Struttura molecolare sul versante basale del podocita. L'integrina α3β1 interagisce con la laminina-521 permettendo così l'ancoraggio dei podociti alla MBG. Immagine ripresa da Zenker 25

M et al. (2009).

Sul versante apicale la membrana plasmatica dei processi pedicellari è ricca di podocalicina, la quale è una proteina trasmembrana O-glicosilata e ricca di acido sialico, responsabile della carica negativa del dominio apicale della membrana. La perdita di questa proteina o della sua carica negativa risulta in retrazione dei processi pedicellari.9 Il mantenimento della polarizzazione cellulare e della struttura dei processi

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pedicellari è permesso da un citoscheletro altamente sviluppato. A livello del corpo cellulare prevale un citoscheletro composto di microtubuli e filamenti intermedi, mentre i microfilamenti di actina predominano a livello pedicellare, dove sono parte di un complesso apparato contrattile. I filamenti di actina mantengono la loro struttura grazie a proteine crosslinker, quali la α-actinina-4, il cui gene, ACTN4, è stato trovato mutato in forme autosomiche dominanti di glomerulosclerosi focale e segmentale.10 L'attività dell'α-actinina-4 è regolata dalla sinaptopodina, una proteina ricca in prolina.11 Sul versante laterale dei processi pedicellari il citoscheletro è legato al complesso della SD attraverso molecole adattatrici quali ZO-1, catenine e CD2AP, che legano proteine quali la nefrina e la p-caderina ai filamenti di actina. Esiste anche un sistema di filamenti di actina a localizzazione subplasmalemmatica, il quale si connette alla podocalicina, attraverso l'erzina e NHERF2 (fattore regolatore 2 dello scambiatore Na+/H+).5

1.4 Slit diaphragm: struttura e natura molecolare La SD è una giunzione cellulare altamente specializzata che connette i processi pedicellari, creando una membrana che copre il poro di filtrazione. Nel 1974 Karnovsky et al.12 ne hanno rivelato l'aspetto al microscopio elettronico (Fig. 1.3) e l'hanno descritta come una struttura zipper-like con pori di diametro più piccolo di quello dell'albumina. Dal punto di vista molecolare nella SD si trovano proteine comunemente presenti nella maggior parte delle giunzioni intercellulari, ma anche proteine a specifica espressione podocitaria, che rendono questa giunzione intercellulare

una

giunzione specializzata nell'ultrafiltrazione renale (Fig. 1.4). Le proteine che costituiscono il complesso della SD, sono: nefrina, NEPH1-2-3, podocina, Fat1, VE-caderina e P-caderina.13

8

Fig. 1.3 Immagine al microscopio elettronico della BFG di un glomerulo renale di topo. La slit diaphragm (indiacata dalle frecce) appare come una linea elettron-densa che collega a ponte processi pedicellari adiacenti. Immagine ripresa da Karnovsky et al. (1974).12

Fig. 1.4. Struttura molecolare della SD. Immagine ripresa da Löwik MM et al. (2009).26

9 La nefrina è stata la prima proteina della SD ad essere stata identificata attraverso clonaggio posizionale del gene che la codifica, NPHS1; mutazioni in questo gene sono responsabili della sindrome nefrosica congenita di tipo finnico, la quale si manifesta con proteinuria massiva già in fase perinatale.14 E' la molecola chiave della SD, in cui svolge un ruolo strutturale, ma anche di signaling. E' una proteina transmembrana di circa 185-200 kDa con un corto dominio intracellulare ed un dominio extracellulare con un motivo prossimale fibronectina-tipo-3-like ed otto motivi distali IgG-like. L'intero dominio extracellulare è lungo circa 35 nm. Molecole di nefrina da adiacenti processi pedicellari interagiscono al centro della SD attraverso interazioni omofiliche, formando una struttura zipper- like al centro della SD (Fig. 1.5 a e b) con pori su entrambi i lati della zona densa centrale.15 Il dominio citoplasmatico della nefrina è impegnato invece in funzioni di signaling intracellulare. La podocina è un'altra importante proteina della SD; è codificata dal gene NPHS2, le cui mutazioni causano forme di sindrome nefrosica steroido- resistente con glomerulosclerosi focale e segmentale a trasmissione autosomica recessiva.16 Appartiene alla famiglia delle stomatine, ed è esclusivamente espressa nel podocita. Ha una struttura hairpin-like con entrambe le estremità localizzate a livello intracellulare. E' localizzata a livello dell'inserzione della SD dove si accumula in forma oligomerica associandosi ai lipid rafts, microdomini specializzati ricchi in glicosfingolipidie e colesterolo; si lega inoltre anche a CD2AP e alla nefrina attraverso il COOH-terminale, presentandosi quindi come una proteina scaffold, essenziale per l'organizzazione del complesso della SD.17 CD2AP è una proteina intracellulare inizialmente caratterizzata come proteina adattatrice dei linfociti T CD2 e successivamente localizzata anche nel citoplasma dei podociti dove connette la nefrina e la SD tutta, al citoscheletro di actina. Topi knock-out per il gene CD2AP muoiono precocemente per insufficienza renale, testimoniando l'importanza di questa proteina nel rene.18 Le proteine transmembrana della famiglia Neph (Neph1, Neph2) sono state localizzate alla SD e sono strutturalmente legate alla nefrina (Fig. 1.5 c); ognuna di esse ha motivi extracellulari IgG-like attraverso i quali forma etero-oligomeri con la nefrina.19

10

Fig. 1.5a Struttura della nefrina: dominio intracellulare, dominio transmembrana e dominio extracellulare con un motivo prossimale fibronectina-tipo-3-like ed otto motivi distali IgG-like; b interazioni omofiliche tra molecole di nefrina provenienti da processi pedicellari diversi, con formazione di una struttura densa centralmente al poro di filtrazione e di una struttura porosa lateralmente. Immagine ripresa da Patrakka J et al. (2007).15

Fig. 1.5c Interazione della nefrina con Neph1 e Neph2. Immagine ripresa da Patrakka J et al. (2007).15

Anche la protocaderina Fat1, P-caderina e la caderina dell'endotelio vascolare (VE-caderina) sono state localizzate a livello della SD. Fat1, insieme a nefrina, Neph1 e podocina, è essenziale per la formazione di una normale barriera di filtrazione glomerulare: topi knock-out per Fat1 presentano proteinuria ed assenza di SD;20 al contrario la P-caderina non sembra essenziale per il funzionamento del filtro renale, mentre il ruolo della VE-caderina nei podociti è ancora sconosciuto. A livello della SD si localizzano anche ZO-1, una proteina intracellulare ampiamente espressa nelle giunzioni strette epiteliali e MAGI-1; il loro ruolo a livello podocitario è, però, ancora sconosciuto.21 A livello della SD si trova anche il canale TRPC6 (Transient Receptor

11 Potential Cation channel subfamily C-6), che appartiene alla famiglia dei canali cationici non selettivi, ed è coinvolto nella regolazione della concentrazione intracellulare di calcio in risposta all'attivazione di vie di trasduzione da parte della fosfolipasi C (PLC). TRPC6 è localizzato in vicinanza della SD dove interagisce con nefrina e podocina.22 Mutazioni nel gene, che codifica per questo canale sono state trovate in famiglie con glomerulosclerosi focale e segmentale a trasmissione autosomica dominante.23

12

Capitolo 2

Il danno podocitario: glomerulosclerosi e sindrome nefrosica

Perchè il podocita possa svolgere le sue importanti funzioni è necessario che la sua complessa architettura cellulare e molecolare sia integra; in particolare non devono esserci danni a carico del complesso della slit diphragm, del citoscheletro di actina, incluse le proteine ad esso associate, del 'microambiente' podocitario, rappresentato dalla membrana basale glomerulare e del signaling intra- ed extracellulare, che contribuisce al mantenimento dello stato differenziato.27 La classica manifestazione del danno podocitario è la proteinuria, per alterazione della barriera di filtrazione glomerulare. Il danno al podocita può derivare da un difetto intrinseco, quale una mutazione in un gene podocitario o da uno stress estrinseco, quale un'infezione o un disordine immunologico. ( Tabella 2.1)

Tabella 2.1 Cause di danno podocitario.

Danno podocitario intrinseco Mutazioni in: geni per fattori trascrizionali geni per proteine del citoscheletro geni per proteine del complesso della SD geni per proteine citoplasmatiche e di membrana geni per proteine mitocondriali geni per componenti della membrana basale glomerulare

Danno podocitario estrinseco infezioni virali farmaci e tossine glomerulomegalia ischemia acuta e microangiopatia trombotica danno immunologico diabete

13

In un podocita sottoposto ad un danno, sia nell'uomo che nel modello animale, è possibile, con il microscopio elettronico, individuare la comparsa di vacuolizzazione, di corpi di inclusione citoplasmatici, il distacco dalla membrana basale glomerulare ed il fenomeno dell'effacement, il quale consiste in un processo attivo di riorganizzazione e ridistribuzione del citoscheletro di actina che porta ad appiattimento, retrazione ed accorciamento dei processi pedicellari, con perdita dell'interdigitazione con i processi delle cellule confinanti. Nel rene umano adulto ci sono circa 500-600 podociti per glomerulo; queste cellule hanno un turnover molto basso, per cui, se alcuni podociti vengono persi per apoptosi o distaccamento dalla MBG, le cellule rimanenti hanno poche possibilità di ricoprire le aree vuote a livello della membrana basale glomerulare. A livello di queste aree si formano delle sinechie con le cellule epiteliali parietali della capsula di Bowman.28 E' cosi che si sviluppa la glomerulosclerosi focale e segmentale (Fig. 2.1).

Fig. 2.1 Danno podocitario e progressione verso la glomerulosclerosi. Quando il danno è severo/persistente si ha morte podocitaria, diminuzione del numero dei podociti, esposizione di regioni della MBG e formazione di sinechie. Il mancato intervento di processi riparativi conduce 29

alla glomerulosclerosi. Immagine ripresa da Ronconi E. et al. (2009).

14

2.1 Glomerulosclerosi focale e segmentale La glomerulosclerosi focale e segmentale (GSFS) consiste in un processo di sclerosi glomerulare caratterizzato da segmentarietà, per la quale la lesione colpisce soltanto parte di un glomerulo e focalità, per cui non tutti i glomeruli sono colpiti (Fig. 2.2 A e B). Le lesioni inizialmente interessano i glomeruli della giunzione cortico-midollare; con il progredire della patologia la sclerosi assume un aspetto più diffuso e globale. Inoltre è solitamente presente ialinosi diffusa, mentre l'indagine di immunofluorescenza comunemente evidenzia depositi mesangiali di IgM e C3.26 La GSFS può essere primitiva o secondaria; le forme secondarie possono essere dovute ad infezioni, quali l'epatite C e l'HIV, a farmaci o tossine, all'obesità, ad ischemia renale acuta.30

A

…..................B Fig. 2.2 A. Aspetto istologico di GSFS. Immagine ripresa da Eddy AA et al. (2003)37; B. Schema di GSFS, in cui si ha sclerosi segmentale del glomerulo, con perdita podocitaria, ed accumulo di 27

matrice extracellulare. Immagine ripresa da Barisoni L. et al. (2007).

15 Il principio fisiopatologico comune alle varie varianti di GSFS è rappresentato dalla perdita di podociti. Il numero di podociti in un glomerulo è un fattore determinante per la possibilità di evoluzione in GSFS; uno studio su un modello murino con espressione transgenica podocitaria per il recettore della tossina difterica ha dimostrato come una perdita podocitaria del 10-20% possa essere recuperata, una perdita del 20-40% risulti in una risposta cicatriziale, mentre per livelli di perdita superiori al 40%, i glomeruli diventino sclerotici e perdano la capacità di filtrazione.31

2.1.1 Altri quadri istopatologici di podocitopatia Il podocita può rispondere al danno anche con il solo fenomeno dell'effacement, senza variazione nel numero di podociti: si ha così il quadro istopatologico della malattia a lesioni minime (MCD, minimal change disease), caratterizzata dall'assenza di alterazioni all'osservazione al microscopio ottico mentre all'esame al microscopio elettronico è visibile la retrazione dei pedicelli. (Fig. 2.3)

Fig. 2.3. Aspetto istopatologico di malattia a lesioni minime. Alla microscopia ottica non sono 35

visibili alterazioni patologiche. Immagine ripresa da Eddy AA et al. (2003).

Altro quadro istopatologico possibile è la sclerosi mesangiale diffusa, caratterizzata da espansione mesangiale, per accumulo di matrice extracellullare, e da ipertrofia podocitaria.27

16

2.2 Sindrome nefrosica Il danno podocitario si esprime clinicamente con la comparsa di proteinuria, ovvero con un aumentata concentrazione urinaria di proteine plasmatiche, che normalmente non superano il filtro renale; tra queste soprattutto l'albumina. In particolare si parla di sindrome nefrosica in caso di riscontro di valori di proteinuria

superiori

a

40mg/m2/h

(o

di

un

rapporto

Proteinuria/

Creatininuria >2.0) con albuminemia inferiore a 2,5g/dL; alla proteinuria si associa un quadro clinico di edemi ed iperlipidemia. La sindrome nefrosica è una patologia renale comune nei bambini: negli Stati Uniti e in Europa l'incidenza è di circa 1-3 bambini su 100.000, con una prevalenza di 16 su 100.000 bambini. Colpisce soprattutto bambini di 3–6 anni. Secondo lo studio ISKDC (International Study of Kidney Disease in Children)32 l'80% dei bambini con sindrome nefrosica risponde positivamente ad 8 settimane di terapia con prednisone. Il rimanente 20%, steroido-resistente, è particolarmente a rischio per lo sviluppo di insufficienza renale terminale, che compare nel 3040% dei casi entro 10 anni dalla diagnosi.33 Si pensa che, nelle forme steroido-responsive, il meccanismo fisiopatologico sia di tipo immunitario, probabilmente legato alla presenza di un fattore proteinurico circolante non ancora identificato, la cui produzione sembra in relazione ad una disfunzione dei linfociti T. 36 Il quadro istopatologico in questi casi è rappresentato, nella maggior parte dei casi, da MCD.32 La principale manifestazione clinica della sindrome nefrosica è l'edema, la cui patogenesi è ancora oggetto di dibattito. Alcuni sostengono la cosiddetta teoria dell'under-filling, secondo la quale l'edema è dovuto a passaggio di liquidi nello spazio interstiziale per riduzione della pressione oncotica plasmatica, a sua volta determinata dall'ipoalbuminemia; secondariamente si sviluppa ritenzione idrosodica per compensare la perdita di volume intravascolare. Altri sono a favore della teoria dell'over-filling, secondo la quale l'edema è dovuto ad un primitivo difetto nell'escrezione del sodio: si realizza quindi un aumentato riassorbimento di acqua ed espansione del volume intravascolare, fino alla comparsa di edema per aumentata pressione idrostatica intravascolare.35 L'edema rappresenta spesso il primo segno clinico: inizialmente si localizza ai tessuti periorbitari ed agli arti inferiori, poi può coinvolgere lo scroto o le grandi

17 labbra fino ad un quadro di anasarca, con versamenti pleurici e peritoneali. All'edema si associa aumento di peso. Gli esami ematici evidenziano ipoproteinemia con ipoalbuminemia ( 40). Il coverage e la profondità media sono stati estratti utilizzando scripts. L'analisi delle varianti è stata effettuata tramite il software GS Reference Mapper (Roche): ogni sequenza letta è così controllata con la sequenza genomica di riferimento (assemblaggio hg19); da questa analisi si genera una lista di varianti ad alta confidenza, le quali sono inizialmente controllate come possibili SNPs attraverso il dbSNP build 135. Di ogni variante nucleotidica identificata dal GS Reference Mapper sono state annotate le coordinate cromosomiche, il gene, il nucleotide wildtype e quello mutato, l'eventuale cambio aminoacidico, la profondità di lettura per quella base e la percentuale di letture che contengono la variante. Per l'identificazione di possibili varianti ai siti di splicing è stata calcolata la distanza di ogni variante dalla più vicina giunzione introne-esone: sono state selezionate le varianti di splicing entro i 10 nucleotidi dalla giunzione.

55 6.4.7 Validazione varianti La validazione dei dati ottenuti mediante l’analisi bioinformatica, è stata effettuata con amplificazione PCR e successiva reazione di sequenziamento. In Tabella 6.3 sono riportate le sequenze dei primers utilizzati. In seguito, di ogni variante aminoacidica validata con metodo Sanger e non descritta nel database HGMD professional http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php, nel quale sono depositate tutte le mutazioni patogenetiche descritte in letteratura, é stata effettuata l'analisi in silico con i programmi di predizione: SIFT-http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html, PolyPhen-http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ edu/pph2/ e pMUT-http://mmb.pcb.ub.es/PMut/PMut.jsp, per distinguere le varianti potenzialmente dannose da quelle con effetto neutrale. E' stato inoltre valutato il grado di conservazione dell’aminoacido wild type nelle diverse specie. Le varianti non sinomine sono state inoltre ricercate nei genitori dei probandi attraverso sequenziamento Sanger. Per quanto riguarda le varianti introniche sono state analizzate con siti di predizione quali Netgene2-http://genes.mit.edu/GENSCAN.html e BDGP-http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html web. Tabella 6.3 Sequenze dei primers utilizzati per la validazione delle varianti. Gene ACTN4 ex8

Forward

Reverse

5’-TCACTCTGCAGGTCCCTCTC-3’

5’-CGTCTGCAAGAGAAATGAGG-3’

5’-TGTGTTCACCATGTGGCTCT-3’

5’-TGTCTTTTCCCTGGTGTTCC-3’

MYO1E ex23

5’-AAAGCAGATTTCAGCAATTTCA-3’

5’-GTGCGATCAAGACCCCTTT-3’

PLCE1ex8

5’-CGACTCTCATGGTTCAGAGGA-3’

5’-GAGGCAGTTGTGGGCTTTAC-3’

PLCE1 ex9

PODXL ex2

5’-ACCCCTCACCCTACAAGTCC-3’

5’-CAAGGCATGAGCCTTTTCAG-3’

LMX1B ex6

5’-GCCAGAAGACTACGGTCCAG-3’

5’-CTTGGTGGAAGGCTTTTGAG-3’

ITGA3 ex2

5’-CCTGGCACCAAGAATCTGTA-3’

5’-TTCATCCGCTCACAGTCATC-3’

PTPRO ex13

5’-CCCAAATCACTCTTCGCAGT-3’

5’-TTTTGCCCAGATAATTAGCCTTA-3’

KIRREL3 ex10

5’-AGACCCTGACCCTCAAATCC-3’

5’-GTCCTTCTTCCCTCCCTCAG-3’

NPHS2 ex1

5’-GCAGCGACTCCACAGGGACT-3’

5’-GAACCTGAGCATCCAGCAAT-3’

NPHS2 ex3

5’-TCTTATGCCAAGGCCTTTTG-3’

5’-CCAATTCTCTCTCTTGGCTACC-3’

NPHS2 ex4

5’-CCCAGTTTGCTGGGATAATC-3’

5’-CCCTAGATTGCCTTTGCACT-3’

NPHS2 ex8A

5’-GTCTCCCCAGCTCAAGACC-3’

5’-GGATGGTGCATTGTGACTTC-3’

CITED2 ex2

5’-TGGGCGAGCACATACACTAC-3’

5’-GGTAGGGGTGATGGTTGAAA-3’

SMARCAL1 ex3

5’-CCAAAATTTCCCAAGGGAGT-3’

5’-GTGCCAAGGGAGGAGAGATT-3’

56

6.5 Array Comparative Genomic Hybridization L'array Comparative Genomic Hybridization (CGH) è stato eseguito utilizzando un microarray custom 180K, secondo quanto previsto dal protocollo di utilizzo della piattaforma Agilent Human Genome CGH Microarray. In particolare il nostro array ad alta densità è stato disegnato tramite il software http://earray.chem.agilent.com/ in modo tale da avere un numero elevato di sonde, ogni 100-200bp, nei 45 geni analizzati tramite NGS. La piattaforma da noi utilizzata consiste in un microarray ad alta risoluzione che permette l’analisi genome wide e la visualizzazione del profilo molecolare di riarrangiamenti genomici con una risoluzione media di 100 kb. Il protocollo seguito prevede 7 passaggi (Fig. 6.10). La fase preliminare consiste nell’estrazione del DNA dal campione di sangue periferico, in seguito 500 ng di DNA purificato del paziente e di un controllo dello stesso sesso (Agilent) sono digeriti separatamente con gli enzimi Alu e Rsal per 2 ore a 37°C. Questo passaggio consente di ottenere frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 200 e 500 bp. I frammenti così ottenuti sono poi denaturati mediante l’aggiunta di 5 μl di Random Primers per 3’ a 95°C e marcati con due cianine di colore diverso; rispettivamente cianina 5-dUTP (Cy5) per il campione e cianina 3-dUTP (Cy3) per il controllo; ed incubati per 2 ore a 37°C. Il DNA così marcato viene poi purificato in colonnine (Amicon Ultra, Millipore), per eliminare i frammenti troppo piccoli, e letto al NanoDrop per determinare la concentrazione finale e l'incorporazione del fluoroforo, parametri necessari per calcolare l'attività specifica. A questo punto 18 μg del DNA marcato del campione e del controllo sono mescolati e uniti a Human Cot-1 DNA (necessario per la saturazione delle sequenze ripetute presenti nel genoma e quindi per ridurre i segnali aspecifici). I campioni così preparati sono denaturati a 95°C per 3 minuti ed ibridati sull'array per 24 ore a 65°C in un termostato a rotazione (20rpm). Al termine dell'ibridazione seguono due lavaggi per eliminare l'eccesso del DNA non ibridato ed il vetrino è poi rapidamente asciugato e posto nello scanner Agilent C. Lo strumento, tramite l’utilizzo di laser, raccoglie l’intensità del segnale luminoso emesso dalle cianine; il rapporto dell'intensità di fluorescenza fra i due fluorofori è proporzionale al rapporto della quantità del materiale genomico del campione e del controllo. Se, quindi, le intensità dei fluorofori sono uguali, la regione analizzata non presenta alterazioni, se, invece, il rapporto Cy5/Cy3 è alterato, si è in presenza di amplificazioni o delezioni. I dati così ottenuti sono poi elaborati con il software Agilent Feature Extraction 10.5 e poi importati nel Genomic Workbench Standard

57 Edition 5.0 software (Agilent Technologies). I dati otttenuti vengono inoltre confrontati con quelli registrati nei database delle varianti genomiche e UCSC.

Fig. 6.10. Workflow Array CGH.

58

Capitolo 7

Risultati

7.1 Targeted resequencing di 45 geni podocitari

7.1.1 Analisi della Run di sequenziamento e della Sequence Capture L’analisi della Run di sequenziamento tramite il software GS Run Browser ha fornito i risultati per la valutazione della qualità dei due sequenziamenti (Tabella 7.1). In entrambi il numero dei pozzetti processati (raw wells) rispetto alla quantità di biglie caricate, sia la quantità di Key Pass wells rispetto al numero di raw wells che la quantità di Passed Filter wells soddisfano i rispettivi indici di qualità. Per ogni campione sono stati inoltre valutati il numero totale di letture, il numero totale di basi lette, la moda della lunghezza dei frammenti, la profondità media del sequenziamento ed il coverage delle sequenze target ad una profondità pari a 1 (almeno una lettura per base), 5 e 10 (Tabella 7.2). Per quanto riguarda la lunghezza dei frammenti letti, la moda è compresa fra 474 e 490 bp (Fig. 7.1), la media delle sequenze mappabili per campione è stata di 82.579 bp distribuite con una profondità media del 67X. La sequence capture è stata buona in quanto in media il 91% di tutte le basi presentano un coverage di 10X; tra i 576 esoni catturati solo 23 esoni, il 4%, è stato poco coperto a causa dell'alto contenuto in GC o della presenza di sequenze ripetute.

59 Tabella 7.1 Analisi Run di sequenziamento.

Corsa 1

Corsa 2

Beads

4.000.000

4.000.000

Raw wells

2.310.453

2.351.786

Key Pass Wells

2.206.042

2.255.925

Dot

42.364

57.509

Mixed

266.326

293.567

Short Quality

432.472

552.682

Short Primer

77

74

Passed Filter Wells

1.462.996

1.351.188

%Dot+Mixed

13.99

15.56

% Short

19.61

24.53

% Passed Filter

66.32

59.90

Failed

Fig. 7.1 Curve di distribuzione della lunghezza delle letture delle due corse.

60

Campione

Letture Mappate

Basi Mappate

Coverage 1X

Coverage 5X

Coverage 10X

Moda della lunghezza delle letture(bp)

Profondità

Caso 1

114734, 97%

42741097, 99%

97%

95%

93%

490

64X

Caso 2

70833, 99%

30098039, 99%

96%

95%

92%

489

77X

Caso 3

139288, 97%

51851370, 99%

96%

95%

93%

486

77X

Caso 4

56821, 99%

24083727, 99%

95%

93%

90%

475

60X

Caso 5

40220, 99%

17043671,99%

95%

91%

87%

474

42X

Caso 6

57675, 99%

24404788, 99%

95%

93%

90%

487

66X

Caso 7

52432, 99%

22265519, 99%

95%

92%

90%

479

55X

Caso 8

30409, 99%

1293033, 99%

95%

92%

84%

480

32X

Caso 9

70704, 99%

29825739, 99%

96%

94%

92%

488

74X

Caso 10

86091, 97%

31774546, 99%

95%

93%

91%

485

54X

Caso 11

133799, 97%

49290095, 99%

96%

94%

93%

486

75X

Caso 12

125341, 97%

46440606, 99%

97%

95%

94%

485

74X

Caso 13

112106, 99%

47357050, 99%

97%

96%

94%

483

124X

Caso14

71907, 99%

30475133, 99%

97%

95%

93%

482

79X

Caso 15

76324, 97%

28049477, 99%

96%

94%

91%

486

49X

Tabella

7.2

Tabella

riassuntiva

dell’analisi

della

run

di

sequenziamento

e

del

coverage.

61

7.1.2 Interpretazione delle varianti geniche identificate

Per definire la patogenicità delle nuove varianti individuate abbiamo applicato i seguenti criteri di selezione: -le varianti devono essere o missenso o alterare siti di splicing; -le varianti non devono essere incluse del dbSNP135 e non devono essere riportate in HGMD (www.hgmd.cf.ac.uk); -le varianti non devono essere presenti con una frequenza piu alta del 5% tra i controlli sani del database “1000 Genomes Project” (www.1000genomes.org); -le varianti non devono essere presenti, con una frequenza più alta del 5%, nel database Kaviar-hg19 (http://db.systemsbiology.net/kaviar/); -le varianti non devono essere presenti con una frequenza maggiore del 15% tra i pazienti affetti da SNSR inclusi nel nostro studio; -le varianti devono essere localizzate in domini proteici altamente conservati tra le specie (almeno tra 6 specie filogeneticamente distanti); -le varianti non devono essere presenti “Exome Variant Server” del “NHLBI Exome Sequencing Project (ESP)” (http://evs.gs.washington.edu/EVS/, release version: v.0.0.10). Inoltre, per determinare se le varianti fossero patogenetiche abbiamo utilizzato programmi di predizione quali Polyphen, Sift e pMut.

Sulla base di questi criteri 10 dei 15 soggetti analizzati presentano varianti causative o potenzialmente casuative. (Tabella 7.3)

62

Campione

Varianti

Dominio proteico

PolyPhen

SIFT

pMut

Madre

Padre

Sequenziamento Sanger

Probabilmente dannosa

Non tollerata

Patologica

wt

mut

Confermata

mut

mut

Confermata

Compreso tra un dominio Coiledcoil e un dominio HARP1

mut

mut

Confermata

Dominio citoplasmatico

mut

mut

Confermata

Entrambe nel dominiio citoplasmatico

mut

mut

Confermata

Entrambe nel dominiio citoplasmatico

mut

mut

Confermata

(Uniprot database)

Caso 1

Negativo

Caso 2

Negativo

Caso 3

Negativo

Caso 4

Negativo

Caso 5

KIRREL3 c.(1166G>A)+(=);

Dominio Extracellulare IG-like C2 Type4

p.(Arg389His)+(=)

NPHS2 c.(-52C>G)

SMARCAL1 c.(243T>C)+(=); p.(Asn81Asn)+(=)

Caso 6

NPHS2 c.(419delG)+(419delG) p.(Gly140Aspfs*41)(Gly140Aspfs*41)

Caso 7

NPHS2 c.(413G>A) + (467_468insT); p.(Arg138Gln) +(Leu156Phefs*11)

Caso 8

NPHS2 c.(104insG)+(1143delC) p.(Gly35Glyfs*35)+(Pro381Profs*5) CITED2 c.(222G>A)+(=); p. (Gly222Gly)+(=)

Dominio ricco di acido aspartico e glutammico

Confermata

63

Caso 9

ITGA3

Dominio extracellulare

c.(259C>T)+(=);

FG-GAP1

Probabilmente dannosa

Non tollerata

Patologica

wt

mut

Confermata

Compresa tra un dominio IQ e un dominio SH3

Benigna

Tollerata

Neutrale

wt

mut

Confermata

Compresa tra un dominio Ras-GEF e un dominio PI-PLC X

Benigna

Non tollerata

Neutrale

wt

mut

Confermata

Dominio CH2

Probabilmente dannosa

Non tollerata

Patologica

wt

wt

Confermata

LMX1B

Porzione

Patologica

wt

mut

Confermata

C-terminale

Probabilmente dannosa

Tollerata

c.(833C>T)+(=);

Benigna

Non tollerata

Patologica

nd

nd

Confermata

p.(Arg87Trp)+(=)

Caso 10

MYO1E c.(2597A>G)+(=); p.(Gln866Arg)+(=)

Caso 11

PLCE1 c.(3197A>G)+(=); p.(Lys1066Arg)+(=)

Caso 12

ACTN4 c.(782C>A)+(=); p.(Val261Glu)+(=)

Caso 13

p.(Ala278Val)+(=)

Caso 14

Caso 15

PTPRO

Dominio extracellulare fibronectina

c.(2279G>A)+(=); p.(Gly760Asp)+(=)

Type III-8

PODXL

Dominio ricco in treonina

Confermata

c.(690C>A)+(=); p.(Gly230Gly)+(=) PLCE1

Compresa tra il dominnio Ras-GEF e PI-PLC X-box

c.(2599G>C)+(=); p. (Thr866Thr)+(=)

Tabella 7.3 Tabella riassuntiva delle varianti identificate nei 15 soggetti inclusi nello studio. nd, non disponibile; mut, mutato; wt , wild type.

Confermata

64

Caso 1 L’analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento con GS FLX Titanium 454 Roche non ha evidenziato alcuna variante di sequenza in questo paziente. Caso 2 L’analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento con GS FLX Titanium 454 Roche non ha evidenziato alcuna variante di sequenza in questo paziente. Caso 3 L’analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento con GS FLX Titanium 454 Roche non ha evidenziato alcuna variante di sequenza in questo paziente. Caso 4 L’analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento con GS FLX Titanium 454 Roche non ha evidenziato alcuna variante di sequenza in questo paziente. Caso 5 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 Roche ha individuato, nel paziente 5, tre diverse varianti nei geni NPHS2, KIRREL e SMARCAL1 (Tabella 7.3) non precedentemente note come SNPs. La variante c.-52C>G nel promotore del gene NPHS2 risultava presente nel 100% di 60 letture (65% di queste sul filamento Forward e 35% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in omozigosi, determina la sostituzione di una Citosina in una Guanina nel promotore a 52 bp dall'ATG, variante già precedentemente associata a SNSR, Oleggini et al115. L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi sia nel padre che nella madre del paziente. Nella regione codificante del gene KIRREL3 è stata individuata la variante nucleotidica c.1166G>A, presente nel 43% di 58 letture (47% sul filamento Forward e 43% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, della Guanina in posizione 1166 con una Adenina, ed il cambio aminoacidico di una Arginina in un'Istidina in posizione 389 (p.Arg389His). Il gene KIRREL3, tra i geni inclusi nel sequencing array, appartiene al gruppo dei geni candidati, in quanto nessuna variante in questo gene è stata ancora descritta come causativa di SNSR. L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stato valutato con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la 64

65 definiscono come probabilmente dannosa, non tollerata e patologica. L'analisi dell'allineamento proteico, importante per capire il grado di conservazione di un determinato aminoacido tra le specie, mostra un buon grado di conservazione, sia dell'aminoacido che del dominio proteico (Fig. 7.2). L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante nel padre del paziente. Nel gene SMARCAL1 l'analisi bioinformatica della run di sequenziamento ha individuato la variante nucleotidica c.243T>C, presente nel 53% di 41 letture, confermata dal sequenziamento Sanger. Questa determina la sostituzione, in eterozigosi, di una Timina con una Citosina in posizione 243 della sequenza codificante; si tratta di una variante silente p.Asn81Asn. Caso 6 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 Roche ha individuato, nel paziente 6, una variante nel gene NPHS2. La variante c.419delG risultava presente nel 100% di 70 letture (63% di queste sul filamento Forward e 37% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in omozigosi, determina la delezione di una Guanina in posizione 419 che determina un fremeshift e quindi l'introduzione di un codone di stop in posizione 181 (p.Gly140Aspfs*41), variante presente in HGMD come causativa di SNSR.116 L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi sia nel padre che nella madre del paziente. Caso 7 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 7, due varianti nel gene NPHS2. La variante c.413G>A risultava presente nel 50% di 70 letture (55% di queste sul filamento Forward e 45% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in eterozigosi, determina sostituzione di una Guanina con un'Adenina in posizione 413 ed il cambio aminoacidico di un Arginina con una Glutammina (p.Arg138Gln), variante presente in HGMD, come causativa di SNSR.116 L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi nel padre del paziente. La variante c.467_468insT risultava presente nel 61% di 50 letture (66% di queste sul filamento Forward e 34% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in eterozigosi, determina 65

66 l'inserzione di una Timina in posizione 467 che determina un fremeshift e quindi l'introduzione di un codone di stop in posizione 167; p.Leu156Phefs*11. Anche questa variante è presente in HGMD, come causativa di SNSR. 117 L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi nella madre del paziente. Caso 8 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 Roche ha individuato, nel paziente 8, due varianti nel gene NPHS2 e una variante nel gene CITED2. La variante in NPHS2, c.104insG risultava presente nel 45% di 40 letture (30% di queste sul filamento Forward e 70% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in eterozigosi, determina l'inserzione di una Guanina in posizione 104 che causa un fremeshift e quindi l'introduzione di un codone di stop in posizione 70 (p.Gly35Glyfs*35), variante presente in HGMD come causativa di SNSR.116 L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi nel padre del paziente. La variante in NPHS2, c.1143delC risultava presente nel 56% di 32 letture (65% di queste sul filamento Forward e 35% sul filamento Reverse) ed è stata successivamente confermata tramite sequenziamento Sanger. Essa, presente in eterozigosi, determina la delezione di una Citosina in posizione 1143 che causa un fremeshift e quindi l'introduzione di un codone di stop in posizione 386 (p.Pro381Profs*5), variante presente in HGMD come causativa di SNSR. 118 L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante in eterozigosi nella madre del paziente. Nel gene CITED2 l'analisi bioinformatica della run di sequenziamento ha individuato la variante nucleotidica c.222G>A, presente nel 51% di 31 letture e confermata dal sequenziamento Sanger. Questa determina la sostituzione, in eterozigosi, di una Guanina con una Adenina in posizione 222 della sequenza codificante; si tratta tuttavia di una variante silente (p.Gly222Gly). Caso 9 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 9, una variante nel gene ITGA3 non precedentemente nota come SNPs. La variante nucleotidica c.259C>T risultava presente nel 43% di 78 letture (47% sul filamento Forward e 43% sul filamento Reverse) e successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, della Citosina in posizione 259 con una Timina ed il cambio aminoacidico di un'Arginina in Triptofano in posizione 87 (p.Arg87Trp). 66

67 L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stato valutato con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la definiscono come probabilmente dannosa, non tollerata e patologica. L'analisi dell'allineamento proteico, importante per capire il grado di conservazione di un determinato aminoacido tra le specie, mostra un buon grado di conservazione, sia dell'aminoacido che del dominio proteico (Fig.7.2). L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante nel padre del paziente . Caso 10 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 10, una variante nel gene MYO1E non precedentemente nota come SNPs. La variante nucleotidica c.2597A>G risultava presente nel 63% di 68 letture (57% sul filamento Forward e 43% sul filamento Reverse) e successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, dell’Adenina in posizione 2597 con una Guanina ed il cambio

aminoacidico

di una Glutammina in Arginina in posizione 866

(p.Gln866Arg). L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stato valutato con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la definiscono come benigna, tollerata e neutrale. L'analisi dell'allineamento proteico, importante per capire il grado di conservazione di un determinato aminoacido tra le specie, mostra un buon grado di conservazione, sia dell'aminoacido che del dominio proteico (Fig.7.2). L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante nel padre del paziente. Caso 11 Nella paziente 11 l’analisi bioinformatica ha individuato una variante di sequenza, non nota come SNPs, nella regione codificante del gene PLCE1. La variante c.3197 A>G, è stata identificata nel 48% di 58 letture, determina la sostituzione, in eterozigosi, di Adenina in Guanina a livello del nucleotide 3197; a livello aminoacidico la Lisina in posizione 1066 è sostituita da un’Arginina (p.Lys1066Arg). La variante è stata validata tramite sequenziamento Sanger. Non è mai stata riportata nella letteratura internazionale ed i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT la definiscono, in relazione al suo possibile effetto dannoso come, rispettivamente, benigna, non tollerata e neutrale. Non è stato possibile eseguire l'allineamento proteico in quanto questa proteina non è 67

68 ancora stata descritta in un numero sufficiente di specie filogeneticamente distanti. L'analisi dei genitori del paziente ha individuato questa variante, in eterozigosi, nel padre. Caso 12 Nella paziente 12 l’analisi bioinformatica ha individuato una variante nella regione codificante il gene ACTN4 non precedentemente nota come SNPs. Nella regione codificante del gene ACTN4 è stata individuata la variante nucleotidica c.782C>A, presente nel 43% di 78 letture (53% sul filamento Forward e 407% sul filamento Reverse) e successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, della Citosina in posizione 782 con un’Adenina, ed il cambio aminoacidico di Valina in Glutammato in posizione 261 (p.Val261Glu). Non è mai stata riportata nella letteratura scientifica, mentre altre varianti nel gene ACTN4 sono state precedentemente descritte come causa di SNSR. L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stata effettuata con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la definiscono come probabilmente dannosa, non tollerata e patologica. L'allineamento proteico (Fig. 7.2) ha mostrato un altissimo grado di conservazione sia dell'amminoacido Valina, qui sostituito, che degli amminoacidi fiancheggianti. La variante è risultata essere una variante de novo, in quanto non presente nei genitori. Caso 13 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 13, una variante nel gene LMX1B non precedentemente nota come SNPs. La variante nucleotidica c.833C>T risultava presente nel 65% di 120 letture (52% sul filamento Forward e 48% sul filamento Reverse) e successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, della Citosina in posizione 833 con una Timina ed il cambio aminoacidico di un’Alanina in Valina in posizione 278 (p.Ala278Val). L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stato valutato con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la definiscono

come

probabilmente

dannosa,

tollerata

e

patologica.

L'analisi

dell'allineamento proteico mostra un buon grado di conservazione, sia dell'aminoacido che del dominio proteico (Fig. 7.2). L’analisi dei genitori ha individuato la stessa variante nel padre del paziente.

68

69 Caso 14 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 14, una variante nel gene PTPRO non precedentemente nota come SNPs. La variante nucleotidica c.2279G>A risultava presente nel 40% di 88 letture (40% sul filamento Forward e 60% sul filamento Reverse) e successivamente confermata dal sequenziamento Sanger. Essa determina la sostituzione, in eterozigosi, della Guanina in posizione 2279 con un’Adenina ed il cambio aminoacidico di una Glicina in Acido Aspartico in posizione 760 (p.Gly760Asp). L’analisi bioinformatica del possibile effetto dannoso della variante è stato valutato con i programmi di predizione PolyPhen, SIFT e pMUT, i quali, rispettivamente, la definiscono come benigna, non tollerata e patologica. L'analisi dell'allineamento p r o t e i c o mostra un buon grado di conservazione, sia dell'aminoacido che del dominio proteico (Fig. 7.2). Non è stato possibile verificare la presenza della variante nei genitori in quanto non ci è pervenuto il DNA. Caso 15 L’analisi bioinformatica del sequenziamento eseguito con GS FLX Titanium 454 ha individuato, nel paziente 15, due varianti rispettivamente nei geni PODXL e PLCE1. Nel gene PODXL l'analisi bioinformatica della run di sequenziamento ha individuato la variante nucleotidica

c.690C>A, presente nel 52% di 51 letture e

confermata dal sequenziamento Sanger. Questa determina la sostituzione, in eterozigosi, di una Citosina con un’Adenina in posizione 690 della sequenza codificante; si tratta tuttavia di una variante silente p.Gly230Gly. Nel gene PLCE1 l'analisi bioinformatica della run di sequenziamento ha individuato la variante nucleotidica c.2599G>C, presente nel 56% di 62 letture e confermata dal sequenziamento Sanger. Questa determina la sostituzione, in eterozigosi, di una Guanina con una Citosina in posizione 2599 della sequenza codificante; anche in questo caso si tratta di una variante silente p.Thr866Thr.

Nei casi, in cui abbiamo identificato varianti in assetto eterozigote (casi 9, 10, 11 e 14), abbiamo effettuato, inoltre, un Array CGH per escludere la presenza di delezioni, duplicazioni o amplificaioni che potessero alterare l'espressione del'allele wild-type. In nessuno dei quattro pazienti abbiamo identificato riarrangiamenti genomici che 69

70 possano contribuire al loro fenotipo clinico.

70

71

Fig. 7.2 Allineamento dei dominii proteici di KIRREL3, ITAG3, MYO1E, ACTN4, LMX1B e PTPRO tra specie filogeneticamente distanti.

71

72 7.1.3.Genotipo e fenotipo clinico Il profilo clinico-patologico di ogni paziente è riportato nella Tabella 6.1. Per quanto concerne le caratteristiche cliniche all’esordio, tutti i bambini presentavano edemi periferici, funzionalità renale nella norma, una severa proteinuria e microematuria; e un solo caso (caso 9) ha avuto ematuria macroscopica intermittente seguita da microematuria persistente. Con l’esclusione di due pazienti in cui l’esordio della SNSR si collocava nel primo anno di vita, entrambi caratterizzati da severe mutazioni a carico del gene NPHS2115,116 che determinano o una completa delezione o una severa riduzione dell'espressione proteica (caso 6 e 7), gli altri bambini portatori di mutazioni patogenetiche non presentavano né un’età d’insorgenza più precoce (mediana 3 anni e 2 mesi (intervallo da 2 anni e 6 mesi-8anni) versus 6 anni(intervallo da 5 anni e 5 mesi15 anni) Mann-Withney test P< 0.12) nè un fenotipo clinico diverso rispetto a quelli negativi al test genetico (Tabella 6.1). Inoltre dei i 4 pazienti, che hanno già raggiunto ESRD (caso 11, 12, 14 e 15), in tre (caso 11, 12 e 14) abbiamo identificato anomalie genetiche. Mentre, solo uno dei cinque pazienti non mutati ha presentato progressivo deterioramento della funzione renale fino all’insufficienza terminale (caso 15) e quattro di loro sono andati incontro a remissione completa (caso 2, 3 e 4) o parziale (caso 1). Possiamo quindi concludere che sulla base del confronto dei dati clinici e del genotipo dei soggetti portatori di mutazioni e di quelli risultati negativi al test genetico, la presenza e il tipo di alterazione genetica non possono essere sospettati sulla base del solo fenotipo clinico del paziente.

7.1.4 Genotipo e risposta alla terapia farmacologica L’analisi retrospettiva della storia clinica ha mostrato che a 12 dei nostri pazienti affetti da SNSR (80%) sono stati somministrati farmaci immunosoppressori (Tabella 7.4); 8 hanno ricevuto ciclosporina (CyA, casi 1-3, 11-15); 10 ciclofosfamide (CF, casi 1-5, 9, 10, 12, 14, 15); 3 micofenolato mofetile (MMF, casi 1, 10, 11), 2 tacrolimus (TK, casi 11, 14), 3 rituximab (Rtx, casi 1, 11, 15), 8 hanno ricevuto una combinazione di due o piu immunosoppresori (casi 1-3, 10-12, 14, 15). Per quanto riguarda la risposta a questo tipo di terapia, solo 3 pazienti hanno mostrato una risposta significativa (CyA nel caso 2 e CF nei casi 3, 4). In tutti e tre la remissione è stata completa e nessuno di questi bambini ha presentato varianti genetiche all'analisi NGS; nel caso 4 che ha risposto a CF, l'analisi istologica ha rilevato un quadro di glomerulonefrite menbranosa (MN, membranous nephropathy). Inoltre, 14 dei 15 pazienti inclusi in questo studio 72

73 sono stati trattati con farmaci inibitori del sistema renina-angiotensina (RAS); cioè con ACE-Inibitori (ACE-Is) e con antagonisti del recettore dell'angiotensina II (sartanici). Sei pazienti hanno ricevuto solo ACE-Is (casi 3, 5, 6, 11, 12, 15) e tra questi solo 2 (casi 3, 5) hanno mostrato una risposta al trattamento. E' da notare che 3 su 4 pazienti che non hanno mostrato nessuna risposta (casi 11, 12, 15), sviluppando un declino della funzionalità renale fino ad arrivare ad ESRD; non hanno risposto neppure al trattamento con immunosoppressori. Il quarto è, invece, un caso di sindrome nefrosica ad esordio precoce, dovuto alla completa assenza della proteina NPHS2 (caso 6). Entrambi i pazienti che hanno ricevuto solo sartanici, hanno raggiunto una remissione completa (RC) (casi 4, 9). Infine tra i bambini a cui è stato somministrato sia ACE-Is che sartanici (casi 1, 7, 8, 10, 13, 14), 4 hanno risposto al trattamento (casi 1, 8, 10, 13) ottenendo remissione parziale (RP) mentre gli altri due (casi 7, 14) hanno mostrato una riduzione della proteinuria non sufficiente a definire una RP, e, quindi, sono stati classificati come AR, assenza di remissione. Questo può essere dovuto al fatto che questi farmaci sono stati somministrati ai bambini o a basso dosaggio o sono stati introdotti solo in una fase avanzata della malattia per controllare l'ipertensione. Concludendo, nel gruppo di pazienti con RC o RP, 5 presentano una mutazione genetica (casi 5, 8, 9, 10, 13) e 4 no (casi 1-4). Sorprendentemente 3 dei 4 bambini senza mutazioni hanno mostrato una remissione completa dopo la terapia con immunosoppressori (casi 2, 3, 4). Nessuno dei 5 pazienti positivi alla ricerca di varianti eseguita con NGS ha risposto, invece, al trattamento con immunosoppressori, mentre ha raggiunto una remissione parziale o completa quando trattato con bloccanti RAS (casi 5, 8, 9, 10, 13). Infine tra i 6 pazienti che non hanno avuto nessuna remissione della malattia, 5 presentano delle anomalie genetiche (casi 6, 7, 11, 12, 14). Questo ci suggerisce che in pazienti affetti da SNSR, una risposta negativa al nostro screening, tramite NGS predice, in maniera robusta, la risposta agli immunosoppressori. Il trattamento con questi farmaci non è al contrario indicato quando la SNSR è associata ad un'anomalia genetica. In questi pazienti è, invece, indicato un trattamento antiproteinurico con inibitori RAS, che devono essere possibilmente somministrati in combinazione, ACE-Is e sartanici alle più alte dosi tollerate dal paziente.

7.1.5 Genotipo e quadro istopatologico della biopsia renale A 14 dei 15 pazienti, inclusi nel nostro studio è stata effettuata la biopsia renale ed il quadro istologico più comune è risultato quello di GSFS (casi 1, 3, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 73

74 15; 60%, Tabella 7.4). Nei casi 2, 5, 11 e 13 (26,7%) il quadro istologico rilevato è stato invece quello di MCD; e nel caso 4 (7%) di una MN. E' interessante notare che uno dei pazienti a cui è stata posta la diagnosi di GSFS (caso 10), mostra una variante collapsing caratterizzata da lesioni massive iperplastiche intraglomerulari.119, 120 Questo bambino è affetto da nefropatia C1q (C1qN, C1q Nephropaty) che ha esordito due settimane dopo l'insorgenza della varicella, inoltre, presenta un fenotipo clinico atipico caratterizzato da una severa SNSR, che non risponde nè al trattamento con CF nè con MMF. É da notare che la glomerulopatia collapsing (CG, collapsing glomerulopathy) è raramente descritta nel contesto di C1qN120. Questo bambino presenta inoltre una mutazione in eterozigosi in MYO1E, che sebbene noi sia causativa di per se, potrebbe aver contribuito al determinarsi di un fenotipo clinico così aggressivo e alla perdita di risposta al trattamento con gli immunosoppressori. Tra i 4 pazienti con un quadro istologico di MCD, uno ha già raggiunto l'ESRD (caso 11), uno ha raggiunto una RP (caso 13) e due hanno avuto una RC. Per quanto riguarda i 9 pazienti con quadro istologico GSFS, 3 presentano ESRD (casi 12, 14, 15), 5 hanno avuto una RP (casi 1, 8, 10) o una RC (casi 3, 9) e 1 non ha avuto remissione (caso 7). Concludendo nella nostra coorte di pazienti, la progressione verso l'ESRD si è verificata solo nei bambini che non hanno avuto risposta a nessun tipo di trattamento, indipendentemente dal quadro istologico rilevato al momento della biopsia. La remissione completa c'è stata solo nei pazienti privi di anomalie genetiche, che hanno risposto completamente alla terapia immunosoppressiva o in pazienti con mutazioni che hanno risposto agli inibitori RAS, indipendentemente dal quadro istopatologico (2 MCD, 2 GSFS and 1 MN). Nei bambini affetti da SNSR, quindi, lo screening NGS rappresenta il miglior predittore della risposta agli immunosoppressori, a prescindere dal quadro istopatologico della biopsia.

74

75 Paziente

Gene

Istol

CyA

Resp

CF

Resp

MMF

Resp

TK

Resp

Rtx

Resp

ACE-Is

Caso 1

nessuno

GSFS

si

no

si

no

si†

non val†

no

/

si

no

ram

Caso 2

nessuno

MCD

si

si

si

no

no

/

no

/

no

/

no

Caso 3

nessuno

GSFS

si§

non val§

si

no

/

no

/

no

/

Caso 4

nessuno

MN

no

/

si

si

no

/

no

/

no

Caso 5

NPHS2

MCD

no

/

si

no

no

/

no

/

Caso 6

NPHS2

no

no

/

no

/

no

/

no

Caso 7

NPHS2

GSFS

no

/

no

/

no

/

Caso 8

NPHS2

GSFS

no

/

no

/

no

Caso 9

ITGA3

GSFS

no

/

si

no

Caso 10

MYO1E

CG,

no

/

si

si

Resp

Sar

Resp

Rem

irb

si

RP

/

no

/

RC

ram

si

no

/

RC

/

no

/

can

si

RC

no

/

ram

si

no

/

RC

/

no

/

ram

no

no

/

AR

no

/

no

/

ram

no

los

no

AR

/

no

/

no

/

ram

si

los

no

RP

no

/

no

/

no

/

no

/

irb

si

RC

no

si

no

no

/

no

/

ram

si

irb

si

RP

resp. inc

C1qN Caso 11

PLCE1

MCD

si

no

no

/

si

no

si

no

si

no

ram

no

no

/

AR

Caso 12

ACTN4

GSFS

si

no

si

no

no

/

no

/

no

/

ram

no

no

/

AR

Caso 13

LMX1B

MCD

si

no

no

/

no

/

no

/

no

/

ram

si

los

si

RP

Caso 14

PTPRO

GSFS

si

no

si

no

no

/

si

no

no

/

ram

no

los

no

AR

Caso 15

nessuno

GSFS

si

no

si

no

no

/

no

/

si

no

ram

no

no

/

AR

Tabella 7.4 Genotipo confrontato con la risposta alla terapia farmacologica e con il quadro istopatologico. Istol, quadro istologico della biopsia renale; Resp, risposta a; CyA, ciclosporina; CF, ciclofosfamide; MMF, micofenolato mofetile; TK, tacrolimus; Rtx, rituximab; ACE-Is, ACEinibitori; Sar, sartanici; Rem, remissione; GSFS, glomerulosclerosi focale e segmentale; MCD, minimal change disease; MN, membranous nephropathy; CG, collapsing glomerulopaty; C1q N, C1q nephropaty; ram, ramipril; irb, irbesartan; can, candesartan; los, losartan; yes, ram, irb, los, il farmaco è ancora utilizzato; /,la risposta non è stata valutata in quanto il farmaco non è mai stato somministrato al paziente; RC, remissione completa; RP, remissione parziale; AR, assenza di remissione; non val, non valutabile; §, per errore il farmaco è stato interrotto dopo poche settimane; †, il farmaco è stato somministrato da poche settimane; resp. inc, risposta incostante.

76

Capitolo 8

Discussione

Negli ultimi anni numerosi geni sono stati associati alla patogenesi della sindrome nefrosica steroido-resistente (SNSR) sia nei bambini che negli adulti. Questi geni codificano per proteine essenziali per l'integrità ed il funzionamento della barriera di filtrazione glomerulare: si tratta soprattutto di geni a specifica espressione podocitaria, che hanno reso il podocita la cellula chiave nella patogenesi delle glomerulopatie.39 Essendo la SNSR una malattia così geneticamente eterogenea e quindi difficile da studiare con le tradizionali tecniche della biologia molecolare, lo scopo di questo lavoro è stato quello di applicare la tecnologia di high throughput sequencing per una più appropriata diagnosi dei soggetti affetti. Infatti numerosi geni dovrebbero essere analizzati uno dopo l'altro per poter raggiungere un'appropriata diagnosi molecolare, cosa spesso non fattibile in termini di costi e di tempi. Il quadro clinico di questa condizione è inoltre variabile, sia per gravità e prognosi, che per età d'esordio, e ciò rende spesso difficile la selezione dei geni da analizzare. A queste difficoltà si associa la crescente consapevolezza che il quadro clinico possa essere il risultato di un genotipo composto, caratterizzato dalla presenza di più mutazioni in geni 40

diversi.

L'analisi molecolare di questi pazienti non può quindi soddisfarsi nell’individuare

una singola mutazione in uno dei geni malattia, ma si deve applicare uno sforzo più estensivo. La recente introduzione della tecnologia Next Generation Sequencing nel campo della biologia molecolare, basata sulla possibilità di eseguire in parallelo numerosissime sequenze, ha decisamente cambiato l'approccio della ricerca scientifica in ambito genetico, permettendo di 114

analizzare la sequenza di grandi quantità di DNA in una singola run di sequenziamento. Questa tecnologia è rapidamente applicabile all'analisi di specifiche sequenze target, consentendo di sequenziare contemporaneamente un ampio e selezionato numero di geni in

77 diversi pazienti (Targeted resequencing).

Il nostro studio è stato effettuato mediante l'utilizzo dello strumento GS FLX Titanium 454 Roche; abbiamo effettuato il Targeted resequencing di 45 geni podocitari in 15 soggetti pediatrici affetti da SNSR sporadica e non sindromica. I geni inclusi nello studio sono rappresentati da tutti i geni malattia noti e da possibili geni candidati, sulla base di studi su modelli animali. Per ogni paziente sono stati selettivamente sequenziati 576 esoni, per un totale di 103.216 base pairs.

L'analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento ha identificato in 10 dei 15 soggetti analizzati mutazioni causative o potenzialmente patogenetiche.

In quattro bambini abbiamo identificato mutazioni nel gene NPHS2, già descritte in HGMD come causative di SNSR115-118, in assetto omozigote (casi 5 and 6) e in assetto eterozigote composto (cases 7 and 8). In particolare il caso 5 presenta una variante nel promotore della NPHS2, già descritta in una larga coorte di pazienti affetti da SNSR con una frequenza T); questo codifica una subunità transmenbrana del recettore dell'integrina essenziale nella segnalazione tra le cellule ed il loro microambiente. Recentemente per la prima volta è stato descritto un fenotipo complesso, in pazienti con mutazione in omozigosi a carico del gene

78 ITGA391,92, caratterizzato da distruzione della membrana basale e compromissione della funzione di barriera, a livello renale, polmonare e della cute. In tutti i pazienti inoltre è presente una grave SNSR. Sebbene nel caso in oggetto non siano state riportate informazioni cliniche relative ai genitori eterozigoti, questo assetto genomico potrebbe essere associato con un fenotipo intermedio (con esclusiva estrinsecazione renale). In letteratura infatti ci sono molti esempi di mutazioni che in omozigosi danno fenotipi molto gravi, mentre in eterozigosi segni clinici più lievi della stessa malattia.121,122 Le stesse considerazioni possono essere effettuate anche per il caso 10, dove abbiamo identificato una mutazione missenso nel gene MYO1E (c.2597A>G). Il bambino presenta una C1qN con un quadro istopatologico di glomerulopatia collapsing, un'associazione che è stata raramente descritta119,120. Sebbene la mutazione non sia causativa di per se, potrebbe contribuire all'instaurarsi di un fenotipo aggressivo e alla perdita della risposta al trattamento del paziante con immunosoppressori. Nel caso 11 abbiamo identificato una nuova variante nel gene PLCE1 (c.3197A>G); questo bambino ha avuto un esordio precoce della SNSR, a due anni, con quadro istopatologico di MCD e rapida progressione verso l'ESRD. Il gene PLCE1 codifica per una proteina che appartiene alla famiglia delle fosfolipasi che catalizza nei podociti l'idrolisi del Fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2), in inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo.123 Mutazioni in omozigosi, eterozigosi composta e eterozigosi sono state identificate in circa il 33% di soggetti con sclerosi mesangiale diffusa e nell' 8% di casi GSFS, in assenza di mutazioni a carico di NPHS2. In questi soggetti non è stata osservata una chiara correlazione genotipo-fenotipo; sono state infatti identificate sia mutazioni troncanti che missenso che hanno determinato un’evoluzione della malattia comparabile. Sorprendentemente soggetti sani e non correlati presentano mutazioni in omozigosi identificate nelle loro rispettive famiglie affette124-126. Molto probabilmente, l'effetto di non penetranza, visto in soggetti asintomatici, ma portatori di mutazioni a carico di PLCE1, è dovuto ad una compensazione esercitata da altri membri della famiglia delle fospolipasi-C122 o più probabilmente a fattori ambientali che interagiscono con la progressione della malattia. Nel caso 12 sorprendentemente, in relazione all'età del paziente abbiamo identificato una variante de novo in ACTN4 (c.782C>A). Mutazioni a carico di questo gene, con eredità autosomica dominante, possono causare GSFS che tipicamente si manifesta durante l'età adulta71,72; fino ad oggi un solo studio ha descritto una famiglia con due fratelli con GSFS che hanno manifestato sindrome nefrosica durante la prima infanzia.127 Nel nostro paziente la SN è esordita all’età di 7 anni e mezzo, e si è mostrata

79 sin dall’inizio resistente a terapia con steroidi e ad altri trattamenti immunosoppressivi. La progressione verso l’ESRD è stata rapida, e ad un anno e mezzo dalla diagnosi il bambino è stato costretto a ricorrere a trattamento dialitico. Nel caso 14 abbiamo identificato una mutazione nel gene PTPRO (c.2279G>A), che codifica una proteina simil recettore protein tirosin fosfstasi appartenente alla famiglia del sottotipo R3. L'importanza di PTPRO nella regolazione della pressione e permeabilità glomerulare è stata già dimostrata in base al fenotipo del modello murino knockout e in studi basati sull'utilizzo di anticorpi neutralizzanti la proteina128. Inoltre, mutazioni in assetto omozigote, a carico di questo gene, sono state associate a sindrome nefrosica con esordio durante la fanciullezza, anche se solo in due famiglie consanguinee. In base ai nostri dati possiamo supporre che anche mutazioni in assetto eterozigote possono essere associate a quadri di SNSR. Infine abbiamo identificato nel caso 13 una nuova mutazione in assetto eterozigote nel gene LMX1B (c.833C>T). Mutazioni a carico di questo gene causano la sindrome di Nail-patella (NPS), una malattia pleiotropica, autosomica dominante nella quale una delle più serie manifestazioni è il danno renale, che è presente in più del 40% dei soggetti affetti.129 Come descritto in letteratura, parenti d’individui affetti apparentemente sani o con manifestazioni cliniche molto sfumate, possono sfuggire alla diagnosi per generazioni, determinando quindi tassi molto bassi di accertamento dei casi. Il classico quadro clinico è caratterizzato da displasia delle strutture derivanti dal mesenchima dorsale: assenza o ipoplasia delle unghie delle mani e piedi; assenza o ipoplasia delle rotule; displasia del gomito che spesso comporta una sublussazione posteriore della testa radiale ed iliaca. Sebbene i corni iliaci siano patognomonici della NPS, non sono tuttavia presenti in tutti i soggetti affetti.130 La nefropatia nella NPS è caratterizzata da un'estrema variabilità fenotipica; la maggior parte (90–95%) di soggetti affetti hanno una lenta e progressiva perdita della funzionalità renale con l'età, approssimativamente il doppio del valore rilevato in soggetti sani durante l'invecchiamento. Questo è probabilmente dovuto a un progressivo ispessimento e disorganizzazione della membrana di filtrazione glomerulare, che determina una diminuzione della permeabilità idraulica della parete del capillare glomerulare.130 Una piccola parte di pazienti (5–10%) presenta, invece, valori di proteinuria più elevati e tende ad avere un progressivo, anche se variabile, percorso verso l'ESRD. Il padre del nostro paziente, che ha la stessa mutazione presenta microematuria persistente ma senza altri segni clinci. Il bambino, dopo un'accurata osservazione clinica, ha mostrato l’assenza della lunula in tutte le unghie delle mani e assenza del nucleo di ossificazione del

80 radio prossimale bilateralmente, fenotipo che fino ad oggi non è mai stato descritto in associazione a NPS, ma che chiaramente appare anormale. Nel caso 15 abbiamo individuato due mutazioni sinonime nei geni PODXL (c.690C>A) e PLCE1 (c.2599G>C). Sebbene queste due varianti non siano considerate patogenetiche sulla base dei criteri utilizzati in questo lavoro, molti studi riportati in letteratura suggeriscono che anche le mutazioni sinonime possano essere patogenetiche determinando splicing aberranti dell'mRNA, alterazioni della stabilità dell’mRNA e quindi dell'espressione proteica.131-134 Non possiamo così escludere completamente il ruolo causativo di queste varianti nell'insorgenza della SNSR nel bambino. L’utilizzo della tecnologia NGS, in questo studio ha quindi consentito l’identificazione di mutazioni causative o potenzialmente patogenetiche nel 67% dei pazienti analizzati. Inoltre abbiamo identificato 6 nuove varianti in geni che raramente sono associati a SNSR nei bambini. In seguito, abbiamo ricercato correlazioni tra il genotipo del paziente e il fenotipo clinico, la risposta alla terapia farmacologica ed il quadro istopatologico della biopsia renale. L'analisi retrospettiva dei dati anamnestici ci suggerisce che non è possibile stabilire correlazioni tra il fenotipo clinico-patologico e presenza o tipo di mutazione; i pazienti risultati portatori di mutazioni non presentano infatti né un’età d’insorgenza più precoce né un fenotipo clinico-laboratoristico diverso rispetto a quelli negativi allo screening, mentre è stato possibile stabilire una correlazione tra il genotipo e la risposta alla terapia farmacologica. Dodici dei pazienti inclusi nello studio sono stati trattati con farmaci immunosoppressori, e la risposta a questi è stata riscontrata solo in 3 pazienti, nessuno dei quali è risultato affetto da mutazione a carico dei geni analizzati. Quattordici pazienti sono stati inoltre trattati con inibitori RAS, sia in associazione ad immunosoppressori che non: una risposta, pur quantitativamente diversa, al farmaco è stata documentata in 8 dei pazienti trattati, 5 dei quali mutati, mentre 6 non hanno ottenuto alcun miglioramento. E’ interessante, tuttavia sottolineare, come tra i bambini che non hanno risposto siano compresi 4 che hanno mostrato rapida evoluzione verso ESRD e i 2 con mutazioni severe nel gene della podocina. Dato ancor più interessante, se si considera l’outcome finale, nel gruppo dei pazienti che hanno ottenuto una remissione, sia questa parziale o completa, 5 sono risultati mutati e 4 no. Tra questi ultimi, 3 hanno mostrato una risposta significativa all’immunosoppressore, mentre i 5 pazienti portatori di mutazione hanno ottenuto una remissione parziale o completa quando trattati con ACE-Is e sartanici.

81 Infine, in 14 dei 15 pazienti è stato possibile allineare i dati genetici con il quadro bioptico. Il pattern istologico più frequente è stasto quello di GSFS, in 9 casi (60%), in 4 pazienti (26,7%) è stato riscontrato invece MCD ed in uno MN; non è stata tuttavia evidenziata alcuna correlazione tra diagnosi istologica e presenza di mutazioni. Concludendo, in pazienti affetti da SNSR, una risposta negativa al nostro screening, tramite NGS, predice in maniera robusta la risposta agli immunosoppressori, a prescindere dal quadro bioptico, e ci impone un trattamento immediato con questi farmaci. Il test genetico con NGS risulta, quindi, uno strumento indispensabile per stabilire approcci terapeutici corretti (terapia immunosoprressiva, antiproteinurica) nei pazienti resistenti ai corticosteroidi e per l’identificazione di casi sfumati di sindromi complesse. La tecnologia N G S consente ad oggi d i analizzare l'intero genoma di un paziente, in tempi e con costi sostenibili. Quindi per le attuali conoscenze e, come punto di partenza, crediamo che il sequenziamento dell'esoma, cioè solo delle porzioni codificanti, possa essere la strada da seguire per quei casi risultati negativi al Targeted resequencing di 45 geni podocitari. Il sequenziamento dell'esoma ha, ad esempio, recentemente permesso di identificare in due fratelli figli di genitori consanguinei affetti da una proteinuria intermittente, una mutazione omozigote frameshift nel gene CUBN, che codifica per la cubulina. Mutazioni in questo gene causano una forma ereditaria di anemia megaloblastica associata a deficit di vitamina B12 e proteinuria nel 50% dei casi.135 Inoltre, il nostro futuro obiettivo sarà quello di ampliare la coorte di pazienti analizzati ed utilizzare la tecnologia Next Generation (in particolare Targeted resequencing) come strumento diagnostico precoce. Questo permetterà di effettuare nei bambini con SN non responsiva alla terapia steroidea, una diagnosi genetica rapida e accurata ed una scelta corretta del trattamento da adottare, riducendo così gli effetti collaterali di farmaci inappropriati ed inefficaci.

82

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