PBP - Unime Group

Studio conformazionale sulle penicilline. Storia. Nel 1928, Alexander Fleming (1881-1955), medico e microbiologo scozzese, osservò, mentre era intento a studiare dei ceppi di stafilococco nei laboratori del Saint Mary’s Hospital di Londra, che una muffa, il Penicillium notatum, la quale aveva contaminato accidentalmente una delle sue piastre di coltura, provocava un alone di inibizione dei batteri situati nelle vicinanze di essa. L’appartenenza della muffa al genere Penicillium, suggerì a Fleming di chiamare questo composto antibatterico “penicillina”. Per tale scoperta, fu insignito del premio Nobel per la medicina nel 1945 (con H. W. Florey ed E. B. Chain).

Biosintesi del peptidoglicano (mureina o mucopeptide batterico). Una delle più importanti caratteristiche della cellula batterica (ad eccezione dei micoplasmi, privi di parete esterna) è quella di essere racchiusa in un contenitore rigido denominato sacculo o parete cellulare (cell-wall), responsabile, inoltre, della differente colorazione assunta con il metodo del patologo danese Gram. Essa ha la funzione di fornire una barriera semipermeabile tra l’interno e l’ambiente esterno e di proteggere la cellula contro le variazioni di pressione osmotica; inoltre, previene la digestione da parte degli enzimi dell’ospite e conferisce al batterio una morfologia ben precisa. Il peptidoglicano è un componente eteropolimerico spongiforme che conferisce una rigida stabilità meccanica alla cellula batterica in virtù della sua struttura a graticcio dai molteplici legami crociati. È denominato “peptidoglicano”, giacché composto da catene di glicani, filamenti lineari costituiti da due carboidrati azotati, gli amminozuccheri N-acetil-glucosamina e acido N-acetil-muramico, che si alternano e che sono uniti tra loro da legami peptidici β-(1,4) (legame scisso dal lisozima o muramidasi). La sua biosintesi può essere suddivisa in tre stadi; il primo stadio, che avviene nel citoplasma, serve alla sintesi dei precursori uridil-difosfato (UDP) acetil-muramil-

1

pentapeptide con racemizzazione della L-alanina in D-alanina; nel secondo stadio, si ha l’unione della UDP-acetil-muramil-pentapeptide con la UDP-acetil-glucosamina, distacco dei nucleotidi uridinici e formazione di un lungo polimero; nel terzo stadio, si ha il completamento dei legami crociati all’esterno della membrana cellulare tramite una reazione di transpeptidazione, con l’enzima legato direttamente alla membrana. In particolare: una molecola di N-acetil-glucosamina-1-fosfato (NAG-1-P) si lega ad una molecola di uridina-difosfato (UDP) e successivamente ad una molecola di fosfoenolpiruvato (PEP) con formazione del lactil etere della N-acetil-glucosamina (o acido muramico); esso funziona da accettore per alcuni aminoacidi (cinque, L-ala-Dglu-L-lis-D-ala-D-ala, per Escherichia coli; dieci non lineari per Staphylococcus aureus), attraverso i carbossili liberi in 3 dell’acido lattico; è da notare la stereochimica D del glutammato e dell’alanina terminale in E. coli, caratteristica importante per proteggere il peptidoglicano dall’idrolisi ad opera delle peptidasi dell’ospite. il prodotto di questa serie di reazioni è il cosiddetto “nucleotide di Park” (acido muramico + pentapeptide); esso viene trasportato sulla parete in accrescimento da un vettore lipidico fosforilato denominato bactoprenolo (BP), con liberazione di una molecola di uridina-mono-fosfato (UMP), che fosforilata a livello citoplasmatico, riprende il ciclo di reazioni iniziali. A questo punto, si ha l’attacco da parte di una molecola di N-acetil-glucosamina (NAG) e l’aggiunta di cinque molecole di glicina, con formazione di un ponte pentaglicinico, responsabile dei legami crociati trasversali della struttura del peptidoglicano. Il complesso neoformato, si libera del vettore e reagisce con un accettore di membrana, cioè una estremità in accrescimento di una delle catene polisaccaridiche del peptidoglicano. La reazione finale consiste nella formazione di un legame ammidico (peptidico) tra l’estremo del ponte pentaglicinico e l’estremo del pentapeptide del polimero adiacente, previa rottura del legame tra le due molecole terminali di D-alanina di quest’ultimo, con eliminazione di una molecola di

D-alanina

e

la

produzione

dell’energia

necessaria

alla

reazione

di

transpeptidazione e di formazione del legame crociato; l’alanina terminale si legherà all’unità lisinica del tetrapeptide adiacente attraverso il residuo pentaglicinico.

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Inattivazione di una PBP transpeptidasica ad opera di una beta-lattamina con formazione di penicilloil-enzima inattivo.

Figura I

Quest’ultimo

passaggio

della

biosintesi

è

una

transammidazione

(o

transpeptidazione, termine più “biochimico”) in cui il gruppo amminico terminale dell’ultima glicina della catena A spiazza l’unità terminale di D-ala sulla catena B vicina (Figura II). Il passaggio è catalizzato da una transammidasi (o transpeptidasi) situata sul versante esterno della membrana citoplasmatica batterica; essa forma un legame covalente transitorio con un suo ossidrile serinico; il completamento del ciclo catalitico rigenera la funzionalità dell’enzima. La transpeptidasi viene acilata sul residuo serinico dalla penicillina, con formazione di penicilloil-enzima inattivo e relativa scissione del legame –CO-NH- dell’anello β-lattamico (Figura I). La transpeptidasi costituisce, quindi, uno dei bersagli delle penicilline (e delle altre betalattamine), in virtù del fatto che sono analoghi strutturali dal dipeptide D-alanina-Dalanina; essa viene indicata come PBP (Penicillins Binding Proteins o proteine leganti le penicilline), di cui sono noti diversi tipi. La lisi dei batteri che solitamente segue l’esposizione ad antibiotici beta-lattamici dipende, in ultima analisi, non solo dall’arresto della sintesi e dal conseguente indebolimento del peptidoglicano, ma anche dall’attività degli enzimi autolitici della parete cellulare, le “autolisine” o idrolasi della mureina (mureina-idrolasi) in grado di depolimerizzare il peptidoglicano stesso, mediante la rottura del legame tra acido N-acetil-muramico e peptide a livello della Dalanina. L’interferenza con l’assemblaggio del peptidoglicano, associata all’attività autolisinica fisiologica potrebbe spiegare in modo soddisfacente la lisi cellulare. L’azione dei beta-lattamici, dipende fortemente dalla velocità di crescita delle cellule batteriche: l’effetto batteriolitico è, infatti, inesistente in cellule quiescenti.

3

Figura II

Parete cellulare dei gram-positivi.

Figura III

Il peptidoglicano dei gram-positivi (Figura III), ha due caratteristiche principali, tali da distinguerlo da quello dei gram-negativi: ha uno spessore maggiore (da 200 a 800 Å) e confina direttamente con l’ambiente esterno. La parte esterna è costituita da un 4

sottile strato di proteine, responsabile dell’antigenicità del batterio e delle sue caratteristiche tropiche; vi sono, inoltre, le porine, canali a permeabilità selettiva. La barriera successiva è rappresentata dal peptidoglicano, il quale è attraversato da molecole di acido teicoico e teicuronico, altamente immunogene, le quali hanno la funzione di ancorarlo alla sottostante membrana citoplasmatica; questi acidi, inoltre, costituiscono un polimero che rende la superficie cellulare altamente polarizzata e con carica negativa, tale da favorire l’ingresso nella cellula di molecole ionizzate con carica positiva (es. streptomicina, antibiotico aminoglicosidico). Sulla membrana fluttuano numerose molecole proteiche, tra le quali i “recettori” delle beta-lattamine, detti PBP, importanti sia per la sintesi che per il riparo della parete cellulare. Gli enzimi inattivanti le beta-lattamine, le famigerate beta-lattamasi (idrolasi dette “penicillinasi” o “cefalosporinasi” nel caso in cui reagiscano rispettivamente con penicilline o cefalosporine), sono secreti all’esterno della parete cellulare.

Parete cellulare dei gram-negativi.

Figura IV

Nei batteri gram-negativi, la parete cellulare è più complessa ed ha caratteristiche più lipoidee (Figura IV). E’ presente, infatti, una membrana esterna, contenente varie proteine, porine e soprattutto i lipopolisaccaridi (LPS). Essi costituiscono le 5

endotossine batteriche e determinano risposte antigeniche, infiammatorie e gli shock settici. Al di sotto è presente uno strato sottile di peptidoglicano (da 20 a 30 Å), ancorato alla membrana soprastante dalle cosidette “lipoproteine di Braun”. Vi è poi uno

spazio

intercellulare

detto

“periplasmico”

e

la

sottostante

membrana

citoplasmatica, in cui fluttuano varie proteine, tra cui le PBP. A differenza dei grampositivi, i batteri produttori di beta-lattamasi appartenenti ai gram-negativi, secernono tali enzimi nello spazio periplasmico, realizzando una situazione più conservativa (economizzazione biosintetica).

Tipologie di PBPS (Penicillins Binding Proteins). Sono note diverse classi di PBPS, le quali rappresentano i “recettori” delle betalattamine. In Escherichia coli (un gram-negativo), per esempio, sono state messe in evidenza sette diverse PBP (Tabella 1). Negli altri batteri gram-negativi è presente uno spettro di PBPS simile a quello di E. coli, con funzioni analoghe, ma caratterizzate da pesi molecolari diversi.

Tabella 1 - Proteine batteriche leganti le penicilline (PBPS) in Escherichia coli

PBP

1a

Peso

Copie

molecolare

per

(daltons)

cellula

91-92.000

230

Funzione enzimatica

Funzione

Risultato

fisiologica

della inibizione

transpeptidasi (parete)

Integrità

Estensione

strutturale

della

delle cellule

parete, lisi

1b

81-86.000

//

//

//

//

2

66.000

20

endopeptidasi

Mantenimento

Forme

della forma a

ovali

bacillo 3

60.000

50

transpeptidasi (setti)

Divisione

Filamenti

cellulare 4

49.000

110

endopeptidasi/carbossipeptidasi

6

Nessuno

5

420.000

1.800

carbossipeptidasi

//

6

40.000

570

//

Nessuno

Il legame delle beta-lattamine alle PBP-1, le serin-transferasi per antonomasia di E. coli e di altri batteri, porta a lisi cellulare; quello alle PBP-2, porta a cellule ovali prive di rigidità e incapaci di riprodursi; quello alle PBP-3, genera batteri di forma allungata, filamentosa, a causa dalla mancanza di un setto; il legame alle PBP-4, -5, -6 non ha, invece, effetti letali. Chiarita l’importanza delle transpeptidasi nella biosintesi del peptidoglicano, si evince che tre PBPS appartengono a tale categoria. Nei batteri gram-positivi il numero di PBPS pare sia variabile, in rapporto alla morfologia cellulare; ad esempio, nei bacilli il numero di PBP è maggiore rispetto ai cocchi ed hanno funzioni più complesse. Le beta-lattamine hanno, inoltre, un’affinità diversa per le diverse forme di PBPS (Tabella 2).

Tabella 2 - Legame delle beta-lattamine alle varie PBPS.

Beta-lattamina

Tipo di PBP coinvolta ( legame % )

benzilpenicillina benzatina

PBP-1 ( 8 % ) PBP-2 ( 0,7 %) PBP-3 ( 2 % ) PBP-4 ( 4 % ) PBP-5 ( 65 % ) PBP-6 ( 21 % )

amoxicillina, varie cefalosporine

PBP-1

mecillinam, cefotaxima

PBP-2

mezlocillina, cefuroxima

PBP-3

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Figura V

Rappresentazione schematica della struttura di una PBP ad attività transpeptidasica (struttura tridimensionale ottenuta mediante diffrazione ai raggi X di colture di pneumococco)

Caratteristiche chimico-fisiche delle penicilline. Tutte le penicilline, studiate con metodi cristallografici ai raggi X, possono essere considerate dei derivati dall’acido 6-amminopenicillanico (6-APA), il quale è costituito da un anello tiazolidinico (A) condensato ad uno β-lattamico (B); quest’ultimo porta un gruppo amminico secondario (R-NH-), al quale si unisce una catena acilica laterale (R-CO-), responsabile delle caratteristiche antibatteriche e farmacologiche delle varie penicilline (Figura VI). Il termine “β-lattame” indica un’ammide ciclica a quattro termini; il suo nome sistematico è azetidinone. Esso costituisce il gruppo “farmacoforo” di tali molecole, ovvero quello che determina l’attività biologica del farmaco. I sali di sodio e potassio delle penicilline sono cristallini e solubili in acqua e possono essere impiegati per via orale e parenterale. Al contrario, i sali di procaina e benzatina della benzilpenicillina sono molto poco solubili: questa proprietà è stata opportunamente sfruttata per creare delle molecole deposito (penicilline ritardo), che iniettate per via intramuscolare rilasciano lentamente la penicillina G, permettendo di mantenere costanti i livelli ematici del farmaco per lunghi periodi.

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Figura VI

Nella forma cristallina anidra, i sali di penicillina sono stabili per lungo tempo (per anni a 4°C); le soluzioni, invece, perdono la loro attività rapidamente e devono essere preparate al momento della somministrazione. Le molecole sono non planari ed otticamente attive e, nel caso più semplice della penicillina G, presentano tre centri di asimmetria (C2, C5 e C6), con una configurazione assoluta di tipo 2S - 5R 6R.

Figura VII

L’anello β-lattamico, dunque, non è planare e si trova in una conformazione assai tesa, essendo i due anelli perpendicolari tra loro (Figura VII). L’azoto β-lattamico, fortemente in tensione, ha caratteristiche più spiccatamente elettrofile rispetto 9

all’azoto esociclico della catena laterale e pertanto tenderà a reagire assai rapidamente con vari nucleofili; in acqua, esso tende a rompersi molto lentamente, ma, in ambiente alcalino, l’idrolisi è molto rapida e porta alla formazione dell’acido penicilloico (sprovvisto dell’attività antibatterica), che decarbossila irreversibilmente per dare l’acido penilloico (Figura VIII). Questa è la stessa reazione catalizzata dalle beta-lattamasi batteriche. Tale reazione è data anche dagli alcoli e dalle ammine. In ambiente acido, invece, l’idrolisi del legame β-lattamico prevede la partecipazione della catena laterale R. Se la catena R ha un gruppo elettron-donatore, il quale viene protonato in vivo divenendo elettron-attrattore, la densità elettronica sul carbonile della catena laterale diminuisce: di conseguenza, vi è una certa protezione delle penicilline dalla degradazione acida. La degradazione può essere ritardata tamponando il pH a 6,0 - 6,8 e mantenendo la preparazione a bassa temperatura. Occorre, inoltre, evitare contaminazioni con zinco e rame che catalizzano l’idrolisi. La catena laterale è quindi responsabile delle caratteristiche “aptofore” delle penicilline, conferendo gastroresistenza e determinando il grado di legame alle PBPS ed alle proteine sieriche; infatti, più lipofila è la tale catena, più saranno pronunciate le caratteristiche di legame alle proteine plasmatiche. Schema della degradazione delle penicilline in funzione del pH.

Figura VIII

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Classificazione delle penicilline. Le penicilline (Figura IX) possono essere classificate in: I. naturali (penicillina G o benzilpenicillina); II. semisintetiche (prodotte dall’acido 6-amminopencillanico o 6-APA

con

catene laterali opportunamente modificate) suddividibili a loro volta in: a. resistenti alle penicillinasi (es. meticillina e isossazolil-penicilline come l’oxacillina); b. ad ampio spettro e/o anti-pseudomonas (es. ammino-penicilline: ampicillina, amoxicillina; acil-ureido-penicilline: azlocillina, mezlocillina, piperacillina;

carbossi-penicilline:

carbenicillina,

ticarcillina,

carindacillina; sulfossi-penicilline: sulbenicillina; amidino-penicilline: mecillinam). Gli inibitori delle beta-lattamasi (tienamicina, acido clavulanico, sulbactam, tazobactam), pur mantenendo una certa attività antibatterica, sono impiegati in virtù del fatto che inattivano irreversibilmente le beta-lattamasi, estendendo, quindi, l’attività dei rispettivi antibiotici ai quali vengono associati. Nessuna penicillina è attiva contro le amebe, i bacilli tubercolari (micobatteri), i plasmodi, le rickettsie, i miceti ed i virus.

Principio attivo

Principali specialità medicinali registrate in Italia

PENICILLINA G benzilpenicillina (solo per SQUIBB®, via iniettiva) BENZILPENICILLINA POTASSICA®, PENICILLINA FARMITALIA® 11

Principali usi clinici

Infezioni del cavo orale, otite media, endocardite streptococcica, meningite e sepsi meningococcica, polmonite, antrace

benzilpenicillina-benzatina (solo per via iniettiva)

DIAMINOCILLINA®

flucloxacillina (per via orale BETABIOPTIC®, e parenterale) CLOXILLIN®, FLUXACIL®, ecc…

Sifilide, meningite, polmonite non complicata, faringite da streptococco Infezioni da streptococchi produttori di beta-lattamasi, otite esterna, polmonite, impetigine, endocardite (in associazione)

amoxicillina (per via orale e ALFAMOX®, AMOFLUX®, parenterale) AMOX®, BRADIMOX®, MOPEN®, VELAMOX®, ZIMOX®, AMOXICILLINA semibranded (es. Ratiopharm), ecc…

Endocardite, antrace, eradicazione di H. pylori, infezioni meningococciche, meningite da Listeria, otite media, polmoniti non complicate, infezioni delle basse vie urinarie, osteomielite da H. influenzae, infezioni dentali, sinusite Indicazioni precedenti amoxicillina + acido AUGMENTIN®, (l’acido clavulanico clavulanico (per via orale e CLAVULIN®, estende l’attività ai ceppi resistenti di S. aureus, E. parenterale) NEODUPLAMOX® coli, Bacteroides, Klebsiella), morsi di animali Infezioni delle basse vie ampicillina (per via orale e AMPICILLINA urinarie, otite media, iniettiva) semibranded, sinusite, bronchite, AMPIPLUS®, AMPLITAL® polmonite non complicata, salmonellosi invasiva piperacillina (solo per via iniettiva, anche in associazione con l’inibitore delle beta-lattamasi tazobactam)

AVOCIN®, CILPIER®, DIPERIL®, PICILLIN®, PIPERACILLINA semibranded, PIPERITAL®, SINTOPLUS®, TAZOCIN® (con il tazobactam)

ticarcillina (solo per via iniettiva)

CLAVUCAR®, TIMENTIN®

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Setticemie da Pseudomonas aeruginosa (in associazione agli aminoglicosidi), infezioni varie (delle vie urinarie, delle vie respiratorie, intraddominali, della cute, appendicite complicata) Infezioni gravi da Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides fragilis e Proteus.

Figura IX

Studio sulla conformazione attiva delle penicilline: prospettive future e conclusioni. Gli isomeri conformazionali (conformeri) di una struttura biologicamente attiva, cioè quegli isomeri che differiscono solo per la disposizione spaziale relativa degli atomi in seguito alla rotazione di una parte della molecola intorno a legami semplici, sono in

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grado di modificare la loro disposizione spaziale per favorire l’interazione con il recettore (fase farmacodinamica); spesso, però, sono separati da barriere energetiche così basse (facilmente superabili a temperatura ambiente), da rendere molto difficile l’identificazione della specie che effettivamente interagisce col recettore. Per ciò che concerne la molecola della penicillina G, essa non possiede un elevato grado di libertà torsionale (grado di “flessibilità” molecolare), giacché i due anelli condensati sono rigidi e perpendicolari tra loro; tuttavia, è possibile la rotazione dei legami semplici della catena laterale in 6, del carbossile in 2 e dei metili in 3. La struttura più stabile (conformazione preferita), corrispondente ad un minimo energetico e che ha la maggiore probabilità di essere presente in miscela, è quella rappresentata nella Figura X, in cui il benzile (-CH2-C6H5), gruppo stericamente ingombrante, è più lontano dal resto della molecola. Non essendo stata chiarita con esattezza la struttura topografica recettoriale, essendo essa stessa variabile e specie-specifica, i metodi di “drug design”, ovvero di progettazione molecolare, sono basati sull’aspetto farmacoforico (“pharmacophore-based”), approccio classico in cui si modificano strutture preesistenti, già attive, al fine di trovare la conformazione bioattiva, quella responsabile dell’effetto biologico. Infatti, non è possibile prevedere la conformazione della penicillina nell’interazione con il suo recettore dalla conoscenza del solo ligando. In ultima analisi, le relazioni struttura - attività (SAR) effettuate sulle penicilline hanno chiarito i seguenti punti: a) l’introduzione di gruppi elettron-donatori (che divengono elettron-attrattori in vivo), sulla

catena

laterale

gastroresistente,

così

in da

6,

stabilizzano

permettere

fenossimetilpenicillina o penicillina V);

14

la

l’intera

molecola,

somministrazione

rendendola orale

(es.

b) l’introduzione di un gruppo amminico primario (elettron-attrattore quando protonato) sul carbonio in α rispetto al carbonile del gruppo ammidico, oltre a conferire acidoresistenza, estende l’attività delle penicilline anche ai gramnegativi (es. ampicillina); inoltre, l’esterificazione del carbossile in 2 dell’anello tiazolidinico, permette la trasformazione in profarmaci (propenicilline), che la liberano più lentamente (es. pivampicillina, doppio estere, che dà una più rapida e completa idrolisi dopo l’assorbimento); c) l’introduzione di gruppi ad elevato ingombro sterico sulla catena laterale in 6 (es. gruppo 2,6-dimetossibenzenico), fa diminuire l’affinità fra farmaco e betalattamasi, conferendo resistenza all’enzima (es. meticillina, uso parenterale; oxacillina, con il gruppo aggiuntivo 5-metil-isossazolico fra l’anello benzenico e il legame ammidico, uso orale); d) in generale, l’introduzione di gruppi idrofobici nella catena laterale indirizza l’attività verso i gram-positivi, mentre i gruppi idrofilici favoriscono l’attività verso i gram-negativi. Quando saranno chiarite con esattezza le varie topografie recettoriali delle penicilline, i chimici farmaceutici potranno isolare la conformazione bioattiva e sintetizzare

analoghi

strutturali

che

consentiranno

di

esercitare

un’azione

stereospecifica solo sulle PBPS ad attività transpeptidasica, cioè quelle responsabili della reticolazione del peptidoglicano; ciò produrrà una notevole riduzione del dosaggio efficace per provocare la lisi cellulare dei batteri ovvero una diminuzione della MIC o concentrazione minima inibente, e un’auspicabile contenimento del fenomeno dell’antibiotico-resistenza, nonché una ulteriore diminuzione dei pochi, ma temibili, effetti indesiderati delle penicilline.

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Figura X

DOTT. DARIO FIUMARELLA I ANNO SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN - FARMACIA OSPEDALIERA UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI CATANZARO [A. A. 2002/03]

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BIBLIOGRAFIA

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