Inquadramento clinico e diagnostico delle malattie muscolari

Inquadramento clinico e diagnostico delle malattie muscolari

MIOPATIE • Le miopatie sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caratterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco.

DIAGNOSI MOLECOLARE nelle MALATTIE MUSCOLARI Limb girdle dystrophies: Dominant 1A: Myotilin; 5q31; Dysarthria 1B: Lamin A/C; 1q21; + Cardiac 1C: Caveolin-3; 3p25; Child onset 1D: 7q Dilated Cardiomyopathy (?1E): 6q23 1F: 7q32 1G: 4p21 Ankle contractures & High CK Bethlem: Collagen VI; 21q22 & 2q37 Central core: Ryanodine receptor (19q13) Cytoplasmic body: 2q24; 2q21 + Other Distal myopathies MPD2: 5q31; ? Emery-Dreifuss: Lamin A/C; 1q21 Facioscapulohumeral: 4q35 Myofibrillar (Desmin storage) Desmin: 2q35; AD or AR αB-crystallin: 11q22 Filamin C: 7q32 LGMD 1A: Myotilin; 5q31 Congenital: SEPN1; 1p36 ZASP myopathy: 10q22 Other Myotonic (DM1): DMPK; 19q13 Myotonic (DM2): ZNF9; 3q21 Oculopharyngeal: PABP2; 14q11 Skeletal + Myopathy Bone fragility: 9p21 Paget disease: VCP; 9p13

Limb girdle dystrophies: Recessive 2A: Calpain-3 ;15q15 2B: Dysferlin; 2p13.1 2C: γ-Sarcoglycan; 13q12 2D: α-Sarcoglycan; 17q21 2E: β-Sarcoglycan; 4q12 2F: δ-Sarcoglycan; 5q33 2G: Telethonin; 17q11-12 2H: TRIM32; 9q31-q33 2I: FKRP; 19q13.3 2J: Titin; 2q31 2K: POMT1; 9q34 Merosin (Laminin α2) Absent: 6q2 Reduced: 6q2 Abnormal: LGMD 2I Caveolin-3 mutation (Gly55Ser)

Limb girdle dystrophies: Xlinked Barth: G4.5 (Tafazzins); Xp28 Becker: Dystrophin; Xp21 Duchenne: Dystrophin; Xp21 Emery-Dreifuss: Emerin; Xq28 Manifesting carriers Dystrophinopathy Myotubularin McLeod Syndrome: XK; Xp21.1; Vacuolar Danon's disease: LAMP-2; Xq24 Excessive Autophagy: Xq28 Mental retardation & Cardiomyopathy

Other inherited myopathy syndromes Barnes's myopathy Cardiac + Myopathy Cardiomyopathy-associated myopathy Cardiomyopathy (?LGMD1B) Dilated Cardiomyopathy: 6q23 Congenital Myopathies: Late-onset Muscular dystrophies Cytoplasmic body myopathies Distal myopathies Excessive autophagy: Xq28 Familial myasthenia gravis FSH dystrophy: 4q35 Hereditary IBM syndromes IBM1: Dominant IBM2: GNE; 9p12; Recessive IBM3: MyHC-IIa; 17p13; Dominant IBM + Paget disease: 9p13; Dominant Metabolic myopathies Glycogen Lipid Mitochondrial Myopathy + PEO: 17p13; Recessive Myotonic dystrophy Other dystrophies Respiratory failure Scapuloperoneal syndromes Skeletal + Myopathy Diaphyseal dysplasia: TGFB1; 19q13 Epiphyseal dysplasia: COL9A3; 20q13 Spheroid body (Myotilin) Tubular aggregates Tubular arrays http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/index.html

DISTROFIE MUSCOLARI • Le distrofie muscolari sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caraterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco. • Il muscolo scheletrico mostra dal punto di vista istopatologico una progressiva sostituzione fibro-adiposa, degenerazione e rigenerazione (DISTROFIA).

Muscolo distrofico

Muscolo normale

H&E

LA BIOPSIA MUSCOLARE • Selezione del muscolo appropriato • Procedura bioptica • Processamento del campione

Criteri di selezione del muscolo da biopsiare • Evitare muscoli troppo deboli (i.e. ampiamente sostituiti da tessuto fibro-adiposo) o muscoli completamente normali (i.e. nessuna alterazione patologica) • Scegliere un muscolo con debolezza di grado moderato (3+-4 MRC) • Il muscolo deve essere esente da recenti traumi (EMG) o da patologia concomitante • Tricipite, bicipite all’arto superiore; quadricipite all’arto inferiore • Indicazioni particolari

PREPARAZIONE del CAMPIONE • Si preleva un frammento di dimensioni adeguate per: – Congelamento • • • •

Routine istopatologica Immunoistochimica Biochimica RNA

– Microscopia elettronica – Colture cellulari

• Il campione per il congelamento viene congelato in isopentano raffreddato in azoto liquido e conservato in ultra-freezer a -80° C.

ROUTINE ISTOCHIMICA ed ISTOENZIMATICA • Ematossilina ed eosina • Tricromica di Gomori • Enzimi ossidativi – NADH-TR – SDH – COX

• ATPasi – pH 4.3 – pH 9.4

• PAS • ORO • Fosfatasi acida

• Morfologia della fibra muscolare, elementi non contrattili del muscolo, nervi, vasi, tessuto connettivo, adiposo, nuclei, “strutture anomale” nelle fibre muscolari (p.es. corpi nemalinici)

• Colorano differenzialmente i diversi tipi di fibra e dimostrano alterazioni nella distribuzione dei mitocondri e delle miofibrille

• Colorano differenzialmente i diversi tipi di fibra e dimostrano alterazioni della innervazione • Colora il glicogeno e gli altri polisaccaridi • Colora i lipidi neutri • Positiva in fibre necrotiche, o in membrane con trasporto attivo

MIOPATIE • Le miopatie sono un gruppo di malattie geneticamente determinate che si caratterizzano clinicamente per una debolezza muscolare progressiva che coinvolge i muscoli dei cingoli scapolare e pelvico e spesso il muscolo cardiaco.

TRASMISSIONE LEGATA AL CROMOSOMA X

DISTROFINOPATIE • Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) • Distrofia muscolare di Becker (BMD) • Portatrice di DMD/BMD

DISTROFINOPATIE • Sono dovute a mutazioni nel gene DMD che mappa sul braccio corto del cromosoma X in p21 e che codifica per una proteina chiamata distrofina

TRASMISSIONE DI UNA MALATTIA LEGATA AL CROMOSOMA X gene DMD mutato

figlia portatrice (50%)

figlio affetto (50%)

DISTROFINA

• • •

Il piu’ grande gene umano (2.700.000 bp) 10 volte piu’ grande di qualsiasi altro gene Espressione: • muscolo scheletrico muscolo liscio • muscolo cardiaco alcune popolazioni neuronali

• • •

Prodotto proteico: DISTROFINA (427 kDa) Componente del citoscheletro Funzioni: – conferisce stabilita’ alla membrana muscolare durante lo sforzo – stabilizza le altre glicoproteine associate alla membrana

•

Quantita’: – 0.002% delle proteine muscolari – 3% delle proteine di membrana

Distrofia muscolare di Duchenne Epidemiologia,tasso di mutazione • Interessa tutte le popolazioni egulmente, elevato tasso di mutazione spontanea – 1/10.000 cellule uovo o spermatozoi hanno mutazioni del gene per la distrofina de novo – 1/3.500 maschi nati vivi sono colpiti da DMD

Distrofia muscolare di Duchenne caratteristiche cliniche • Periodo neonatale nella norma • Ritardata l’acquisizione delle tappe motorie • Esordio della debolezza muscolare prossimale verso i 2-3 anni • Debolezza e/o atrofia muscolare progressiva • Perdita della deambulazione verso i 10-12 anni • Prognosi basata sulla funzionalita’ respiratoria e cardiaca

Misurazione manuale della forza muscolare M.R.C. (Medical Research Council) 5

Normale

4

Movimento possibile anche contro resistenza, non massimale

3

Movimento possibile solo contro gravita’ ma non contro resistenza

2

Movimento possibile solo con gravita’ eliminata

1

Contrazione muscolare senza movimento

0

Nessuna contrazione

Si assegna un punteggio da 0 a 5 per ogni muscolo testato

Protocollo di valutazione GSGC 1) MARCIA (GAIT) 1. Normale 2. Lievemente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 3. Moderatamente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 4. Severamente ancheggiante, in iperlordosi e/o sulle punte dei piedi 5. Cammino possibile solo con assistenza (p.es. stampelle, tutori di posizione, etec.) 6. Mantiene la stazione eretta, ma incapace di camminare 7. Confinato in sedia a rotelle Tempo di percorrenza di 10 metri: .................sec.

2) SALIRE le SCALE (STAIRS) 1. Sale senza appoggio 2. Sale con la spinta di una mano sulla coscia 3. Sale con la spinta di entrambe le mani sulle coscie 4. Sale in posizione eretta ma con l’aiuto del corrimano 5. Sale con appoggio di entrambe le mani sul corrimano 6. Sale solo pochi gradini 7. Incapace di salire le scale Tempo per salire 4 gradini: ……………..sec.

(Gait, Stair, Gowers, Chair)

3) DA SEDUTO AD ERETTO (GOWERS) 1. Normale 2. Solleva il bacino per primo, una mano sul pavimento 3. Solleva il bacino per primo, due mani sul pavimento 4. Si appoggia con una mano sulla coscia 5. Si appoggia con due mani sulle coscie 6. Si solleva solo con l’appoggio agli oggetti vicini (tavolo, sedia, etc.) 7. Incapace di alzarsi da terra Tempo per alzarsi da terra: ……………sec.

4) ALZARSI DA UNA SEDIA (CHAIR) 1. Normale 2. Su base allargata e/o difficolta’ ma senza appoggio 3. Con appoggio di una mano sulla coscia 4. Con appoggio di entrambe le mani sulle coscie 5. Con appoggio sulla sedia o oggetti vicini 6. Incapace di alzarsi Tempo per alzarsi da una sedia: ……………..sec.

Distrofia muscolare di Becker caratteristiche cliniche • Esordio della debolezza muscolare prossimale tra i 5-15 anni nelle forme precoci, ma anche esordi tardivi nella terza o quarta decade ed oltre • Debolezza e/o atrofia muscolare progressiva • Perdita della deambulazione dopo i 15 anni • Fenotipo clinico estremamente eterogeneo • Prognosi basata sulla funzionalita’ respiratoria e cardiaca

Polimorfismo clinico nei pazienti con BMD • • • • •

IperCKemia, mialgie, crampi Mioglobinuria, intolleranza all’esercizio Miopatia dei quadricipiti Miopatia ad esordio tardivo Cardiomiopatia dilatativa X-linked

Dati ecocardigrafici in pazienti BMD

Correlazioni fra LVEDV e LVEF ed eta’ dei pazienti BMD

CASO ISOLATO di DEFICIT di FORZA PROGRESSIVO

ALGORITMO DIAGNOSTICO Anamnesi ed esame neurologico Esami generali: ↑ CPK EMG: miopatico/neurogeno

BIOPSIA MUSCOLARE (immunoistochimica, immunoblotting)

Analisi del DNA

Nei muscoli dei vertebrati la fosfocreatina costituisce una riserva di gruppi fosfato che possono esere trasferiti all’ATP. fosfocreatina+ ADP + H+ → ATP + creatina Enzima che catalizza la reazione = creatina chinasi

Anamnesi ed esame neurologico Prelievo di sangue

Biopsia muscolare

DNA

PROTEINE

DIAGNOSI

Analisi proteica distrofinopatie

* muscolo normale muscolo DMD distrofina normale distrofina assente

muscolo BMD distrofina ridotta

C C C P C C C distrofina 427 kDa miosina

fibre “revertite” (30% dei casi)

DISTROFIA DI DUCHENNE ricerca di mutazioni nel gene per la distrofina P1

P2

C

C

P1 45 48 8 50 6 49 51 43 44 47 52

P2

C

19 17 12 13 4 60

P1 deleto esone 51 P2 deleto esoni 48-52 compresi

Mutazioni del gene per la distrofina

• •

Tipo di mutazione

DMD

BMD

Delezione di uno o piu’ esoni

65%

85%

Duplicazione di uno o piu’ esoni

6-10%

6-10%

Mutazioni puntiformi

25-30%

5-10%

2 hotspots: uno nel dominio rod (esoni 45-55) ed uno alla estremita’ 5’ (esoni 2-19) Lo screening di 19 esoni identifica il 98% delle delezioni

GENE per la DISTROFINA quadro di lettura DP427 muscolo, neuroni 2

1

15

3

16

4

5

17

6

7

19 con

18

8

9

20 21 slittamento

10

11

12

23

22

24

13

14

25

26

DP260 retina 28

27

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

DP140 neuroni, rene 42 40 41 senza-slittamento

39

43

44

46

45

47

49

48

50

DP116 cellule di Schwann 52

51

54

53

55

56

58

57

60

59

61

DP71 – 45 universale 62

77

63

78

64

65

79

66

67

68

69

70

71 72

73

74

75

76

Mutazioni frame-shift e in-frame gene DMD distrofina sintrofina nNOS

distrobrevina α-actinina

Mutazioni frame-shift

actina

Mutazioni in-frame C P P C P C

* * distrofina assente

Fenotipo severo DMD

C

*

distrofina di ridotta aaaaaaquantita’ e/o aaaaapeso aaaaamolecolare

Fenotipo mite BMD

DISTROFIA MUSCOLARE di DUCHENNE •

• • •

Miglioramento e mantenimento della forza muscolare e funzione muscolare Prevenzione e gestione delle deformita’ spinali Gestione delle complicanze respiratorie Prevenzione e trattamento della cardiomiopatia

FOLLOW-UP CLINICO nelle DISTROFINOPATIE

• Valutazione neurologica • EKG, ecocardiogramma e visita cardiologica • Spirometria, emogas analisisi e visita pneumologica • Visita fisiatrica e cicli di FKT • Valutazione nutrizionale

TRATTAMENTO delle DISTROFINOPATIE • Mantenere la deambulazione (ortesi, fisiatria, interventi chirurgici) • Prevenire l’insufficienza respiratoria (ventilazione non invasiva) • Prevenire l’insufficienza cardiaca (profilassi precoce con ACE inibitori) • Trattamento farmacologico

Distrofia muscolare di Duchenne perdita della deambulazione 19

17

Age at loss of ambulation

15

13

11

9

7

5

3

Natural history DMD (n=85) Steroid treated DMD (n=41)

PORTATRICI di DISTROFIA MUSCOLARE di DUCHENNE • Il 90% delle portatrici di DMD e’ asintomatico • Circa il 10% delle portatrici di DMD presenta segni clinici di miopatia

Poche fibre distrofino-negative

Molte fibre distrofino-negative

INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X “RANDOM” cromosoma X con il gene per la distrofina normale attivo in ~ 50% delle cellule

dysdys+ dys- dys+ dys+ dysdysdys+ dys+ dysdysdys+ dys+ dys- dysdys+

INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X “SBILANCIATA” Cromosoma X con il gene per la distrofina normale in ~ 100% delle cellule

dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+ dys+dys+ dys+

dysdysdys- dysdysdysdysdysdysdysdysdys-

portatrice sintomatica

Cromosoma X con il gene per la distrofina mutato dysdysin ~ 100% delle cellule dys-

sospetto di distrofia muscolare biopsia muscolare

IF distrofina assente

DMD

mosaico

DMD carrier

ridotta

normale

immunoblot distrofina ridotta

normale

BMD

LGMD?

LGMD • Coinvolgono prevalentemente i muscoli prossimali con risparmio dei muscoli faciali, extraoculari e faringei • Ampia sovrapposizione tra i vari quadri clinici delle diverse LGMD → eterogeneita’ clinica • Mutazioni in numerosi geni causano LGMD → eterogeneita’ genetica

Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche dominanti (LGMD1)

LGMD

INHERITANCE LOCUS

PROTEIN

LGMD1A

AD

5q

myotilin

LGMD1B

AD

1q11

LGMD1C

AD

3p

caveolin

LGMD1D

AD

6q22

-

LGMD1E

AD

7q

-

LGMD1F

AD

7q

-

LGMD1G

AD

4p21

-

lamin A/C

Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche recessive (LGMD2) LGMD LGMD2A LGMD2B LGMD2C LGMD2D LGMD2E LGMD2F LGMD2G LGMD2H LGMD2I LGMD2J LGMD2K LGMD2L LGMD2M LGMD2N

INHERITANCE LOCUS AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR

15q 2p 13q 17q 4q 5q 17q 9q 19q 2q31 9q34 9q31 1p34 14q24

PROTEIN calpain-3 dysferlin γ-sarcoglycan α-sarcoglycan β-sarcoglycan δ-sarcoglycan telethonin TRIM32 FKRP titin POMT1 FKTN POMGnT1 POMT2

LGMD2D Chr. 17q12-21 LGMD2C Chr. 13q12 LGMD2E Chr. 4q12

LGMD2F Chr. 5q33-34

DMD/BMD Chr.Xp21 LGMD1C Chr.3p FKRP

LGMD2B Chr.2p

LGMD2A Chr.15q

LGMD2I Chr 19q13.3

LGMD1B Chr.1q

Calpainopatie (LGMD2A) • • • • •

Esordio clinico usualmente entro le prime decadi Coinvolgimento del cingolo scapolare all’esordio (forma di Erb) o del cingolo pelvico con risparmio degli abduttori delle coscie; Ipotrofia muscolare e scapola alata frequenti; Contratture dei tendini di Achille all’esordio; Insufficienza respiratoria

Disferlinopatie (LGMD2B) LGMD • • • •

Esordio nell’eta’ giovanile Lentamente progressiva Esordio nei muscoli prossimali del cingolo pelvico Risparmio dei muscoli della loggia anteriore della gamba e dei muscoli distali degli arti

Miopatia distale (miopatia di Miyoshi) • • • •

Esordio nella vita adulta Precoce coinvolgimento del gastrocnemio (impossibilita’ a camminare sulle punte dei piedi) Ipotrofia distale arti inferiori Frequente progressione ai muscoli prossimali ed al cingolo scapolare

Sarcoglicanopatie (LGMD2C-F) • Esordio clinico variabile (dall’infanzia alla vita adulta) • Coinvolgimento del cingolo pelvico maggiore del cingolo scapolare; • Ipertrofia dei polpacci comune; • Variabile progressione: da molto severa (DMD-like) a molto mite; • Coinvolgimento cardiaco (LGMD2E-2F) e respiratorio frequenti

LGMD2I • • • • •

Esordio clinico variabile (dall’infanzia alla vita adulta) Coinvolgimento del cingolo pelvico e cingolo scapolare; Ipertrofia dei polpacci e della lingua comune; Variabile progressione nella LGMD2I: da molto severa (DMD-like) a molto mite; Cardiomiopatia dilatativa ed insufficienza respiratoria comuni nella LGMD2I

ISTOPATOLOGIA

severa

moderata

mite

Pattern distrofico o miopatico di variabile severita’

Il fenotipo clinico e la patologia muscolare sono aspecifiche CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche dominanti (LGMD1) LGMD

INHERITANCE

CHROMOSOME

PROTEIN

LGMD1A

AD

5q

myotilin

LGMD1B LGMD1C

AD AD

1q11-21 3p

lamin A/C caveolin

LGMD1D

AD

6q22

-

LGMD1E LGMD1F

AD AD

7q 7q

-

LGMD1G

AD

4p21

-

Distrofie muscolari dei cingoli autosomiche recessive (LGMD2) LGMD

INHERITANCE

CHROMOSOME

PROTEIN

LGMD2A

AR

15q

calpain-3

LGMD2B

AR

2p

dysferlin

LGMD2C

AR

13q

γ-sarcoglycan

LGMD2D

AR

17q

α-sarcoglycan

LGMD2E

AR

4q

β-sarcoglycan

LGMD2F

AR

5q

δ-sarcoglycan

LGMD2G

AR

17q

telethonin

LGMD2H

AR

9q

TRIM32

LGMD2I

AR

19q

FKRP

LGMD2J

AR

2q31

titin

LGMD2K LGMD2L

AR AR

9q34 9q31

POMT1 fukutin

III-20 control

237 kDa

Dysferlin -> LGMD2B

94 kDa

Calpain -> LGMD2A 50 kDa

α-sarcoglycan

myosin

-> LGMD2D

α-sarcoglycan LGMD2D

γ-sarcoglycan

LGMD2C

β-sarcoglycan LGMD2E

telethonin

LGMD2G

Laminin α2

α-dystroglycan

Control

III-20

LGMD2I/2K/2L

ALGORITMO DIAGNOSTICO Anamnesi ed esame neurologico Esami generali: ↑ CPK EMG: miopatico/neurogeno

BIOPSIA MUSCOLARE (immunoistochimica, immunoblotting)

Analisi del DNA

Un approccio pratico alle distrofie muscolari Storia ed esame obiettivo:

Esami generali: ↑ CPK

Distrofia muscolare Biopsia muscolare Distrofia/miopatia Miopatia infiammatoria

Atrofia neurogena

BIOPSIA MUSCOLARE

Analisi immunoistochimica ed immunoblotting delle proteine coinvolte nelle distrofie muscolari

Analisi genetica

Coinvolgimento dei muscoli mimici

DISTROFIA FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSH)

Distribution of predominant muscle weakness in different types of dystrophy

DMD/BMD

FSH

LGMD Lancet 2002; 359: 687-695

FSHD • Autosomica Dominante (10% nuove mutazioni, 45% mosaicismo germinale)

• Prevalenza 1: 20,000 • Penetranza incompleta: – 83% all’eta’ di 30 anni (piu’ alta nei maschi (95%) che nelle femmine (69%)

• Non-penetranza: inferiore al 2% dopo i 50 anni

FSHD • Esordio: M=16 anni F=20 in media, ma possibile dalla prima alla sesta decade • Variabilita’ intra ed interfamiliare (nei casi familiari fino al 40% delle femmine ed al 20% dei maschi possono essere asintomatici)

FSHD • Esordio: – Debolezza muscolare a carico di: • Muscoli facciali (anche asimmetricamente) • Muscoli del cingolo scapolare • Muscoli estensori dei piedi (piede cadente)

• Progressione della debolezza muscolare – Muscoli addominali – Muscoli estensori dei piedi – Muscoli del cingolo scapolare (deltoide risparmiato) – Muscoli del cingolo pelvico

FSHD • Sintomi associati: – Difetti di conduzione (p.es. blocco di branca) (5%) – Scoliosi – Contratture infrequenti, tranne che alla tibiotarsica – Petto excavatus (5%) – Perdita dei toni alti all’audiogramma (75%) – Vasculopatia retinica (teleangectasie e microaneurismi capillari) (60%) – Sindrome di Coat rara (larghi essudati ed emorragie) (1%)

Vasculopatia retinica teleangectasie e microaneurismi capillari

FORMA INFANTILE Circa il 2-4% di tutti i casi di FSH. Esordio della debolezza facciale prima dei 5 anni (difficoltà a dormire con gli occhi completamente chiusi, difficoltà a sorridere) e della debolezza al cingolo scapolare prima dei 10 anni. Severa e diffusa debolezza che coinvolge anche il cingolo pelvico, raramente asimmetrica. 10-20% dei casi perdono la deambulazione, di solito prima dei 15 anni Possibile ritardo mentale, epilessia, coinvolgimento cardiaco, sordità, vasculopatia retinica. Frammento D4Z4 di piccole dimensioni (genitori lievemente affetti o mosaici)

DISTROFIA FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSH) basi molecolari • •

•

•

Linkage sulla regione subtelomerica del cromosoma 4 (4q35) Nella regione telomerica del cromosoma 4 e 10 è localizzata una sequenza polimorfica di DNA detta D4Z4, costituita da unità ripetute in tandem della dimensione ciascuna di 3.3 kb Il numero di “repeats” varia da 11 a 150 nei controlli, rendendo le dimensioni del frammento variabili da 35 a 300 kb (11 o piu’ D4Z4 repeats). Patologico: meno di 35 kb, meno di 11 D4Z4 repeats

(D4Z4)n cen

(

D4Z4

D4Z4

D4Z4

D4Z4

D4Z4

cromosoma 4q35

D4Z4

D4Z4

D4Z4

)n

tel

DISTROFIA FACIO-SCAPOLOOMERALE (FSH) (D4Z4)n = range normale oltre a 11 sequenze ripetute (frammenti superiori alle 50 Kb) MUTAZIONE: sequenze D4z4 inferiori a 11 (frammenti inferiori alle 38 Kb)

→ ANTICIPAZIONE non su base genetica (frammento stabilmente trasmesso)

Goto et al; Neuromusc Disord 2006; 16:256-261

CORRELAZIONI GENOTIPO-FENOTIPO C’è una correlazione tra l’ampiezza del frammento D4Z4 e l’età di esordio e di perdita di deambulazione. Solitamente, tanto più piccolo è il frammento, tanto peggiore è il fenotipo. da 1-3 repeats ( homodomain gene DUX) • Controllo trascrizionale di geni “vicini” alle sequenze D4Z4 (effetto posizionale) (FRG1, ANT1, PDLIM3) • Delezione di un silenziatore trascrizionale localizzato in D4Z4 che comporta la sovraespressione nel muscolo di pazienti affetti da FSH di geni localizzati centromericamente alle sequenze D4Z4 in 4q35 (un “interruttore” genetico che non funziona lascia acceso un gene che normalmente dovrebbe restare spento).

MIOTONIE

MIOTONIA: ALTERATO RILASCIAMENTO MUSCOLARE DOPO CONTRAZIONE MUSCOLARE PROTRATTA

Electromyography Myotonia A WT

Mutant

1 mV 0.5 s

B

1 mV

Courtesy of Lawrence J. Hayward

0.1 s

Myotonic Signs • Eyelid myotonia after squinting • Lid lag myotonia after sustained upgaze • Percussion myotonia

Classificazione delle miotonie • Miotonina protein kinasi (DM1) – Distrofia miotonica tipo 1 (AD)

• Zinc finger protein 9 (DM2) – Distrofia miotonica tipo 2 (DM2) (AD)

• Canale del cloro – Miotonia congenita di Thomsen (AD) – Miotonia congenita di Becker (AR)

• Canale del sodio – Paramiotonia congenita – Miotonia aggravata dal potassio

MIOTONIA Distrofia miotonica (DM1)

DMPK

Distrofia Miotonia Miotonia miotonica Congenita di Becker (DM2)

ZNF9

Miotonia Paramiotonia aggravata dal Congenita Potassio

Canale del Canale del Canale del Cl- (CLCN1) Cl-(CLCN1) Na+ (SCN4A)

Canale del Na+ (SCN4A)

EPIDEMIOLOGIA delle DM • DM1 – Incidenza: 13 : 100,000 – Prevalenza: 2-5 / 100,000

DISTROFIA MIOTONICA tipo 1 o Distrofia miotonica di Steinert • Pleiotropismo → coinivolgimento di piu’ organi

DISTROFIA MIOTONICA (DM1) • •

Miotonia (alterato rilasciamento muscolare) Debolezza muscolare e atrofia – Muscoli mimici, temporali, muscoli distali dell’avambraccio, muscoli dorsiflessori del piede

• • • • •

Cataratta Calvizie precoci Cardiomiopatia (difetti di conduzione, iniziali; cardiomiopatia dilatativa tardiva) Atrofia gonadica, altri disturbi endocrinologici Deficit cognitivo fino alla demenza

DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 1

Christmas tree cataract

PROFILO NEUROCOGNITIVO • La popolazione DM1 è estremamente eterogenea. • Nel complesso non si evidenzia un significativo deficit cognitivo, con QI medio ancora nella norma. • I singoli test documentano: • deficit di funzione frontale; • deficit di abilità visuo-spaziali.

DISTROFIA MIOTONICA CONGENITA • Trasmissione per via materna (la madre ha spesso un fenotipo mite o subclinico -> anticipazione)

• Assenza di miotonia nelle forme congenite (puo’ comparire dopo i 2-3 anni)

• Caratteristiche cliniche pre-, post-natali – – – – – –

Idrope fetale Ipotonia Distress respiratorio Debolezza muscoli facciali Difficolta’ nella deglutizione Piede torto e/o contratture multiple

• Caratteristiche cliniche durante l’infanzia – – – –

Dismorfia facciale Ritardo tappe psico-motorie Ritardo nell’acquisizione del linguaggio Ritardo mentale

DISTROFIA MIOTONICA: 19q13.3 (autosomica dominante) • Gene responsabile: DMPK • Proteina: DMPK (serin-treonin kinasi) ATG 1 2

3

5’ UTR 14 kb gene; 2.3 kb mRNA

4

5

6 7 8

9

10

11 12 13 14

TAG 15

(CTG)n 3’ UTR

DISTROFIA MIOTONICA (DM1) (CTG)n = range normale 3-37; Eterozigosita’: 0.75% MUTAZIONE > 50 (CTG)n

→ instabilita’ meiotica e mitotica

normale

DM1

→ ANTICIPAZIONE Classe E1 = 50-200 (CTG)n Classe E2 = 200-1,000 (CTG)n

mosaico somatico

Classe E3 = > 1,000 (CTG)n

* ** * ** * * * Bonifazi, E. et al. Clin Chem 2006;52:319-322

1,300(CTG)n

80 (CTG)n

Diagn Mol Pathol 1998 7:135-137 Am J Med Genet 1996; 65: 342-347

DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 1 (DM1) Fenomeno dell’anticipazione

DM1: IPOTESI PATOGENETICHE •

Effetto dominante negativo dell’RNA:

↓ •

i trascritti che contengono la sequenza ripetuta CUG si accumulano come inclusioni ribonucleiche nel nucleo (foci di RNA)

↓ •

Alterazione dell’attivita’ di numerose proteine che legano l’RNA (RNA binding protein)

↓ •

Splicing alternativo e funzione anomala di numerosi geni target

↓ •

L’effetto tossico è proporzionale all’entità dell’espansione: più mRNA-CUG Æ più tossicità

Iter diagnostico • EMG: miopatia e miotonia • ECG: difetti di conduzione • Biopsia muscolare: ipotrofia di fibre di tipo I con nuclei centrali e masse sarcoplasmatiche o aggregati tubulari

• Genetica:

malattia autosomica dominante con variabilita’ clinica

ISTOPATOLOGIA DM1

SDH: Ipotrofia delle fibre di tipo I (scure). H&E: Nuclei centrali e polidimensionalismo fibrale.

ISTOPATOLOGIA DM1

H&E

H&E • • • •

NADH

Polidimensionalismo fibrale Nuclei centrali Fissurazioni citoplasmatiche Aggregati tubulari

DISTROFIA MIOTONICA tipo 2 o PROMM • Pleiotropismo → coinivolgimento di piu’ organi

DISTROFIA MIOTONICA di TIPO 2 – DM2 mappa su 3q21; causata da una espansione di una (CCTG)n nel primo introne della proteina zinc finger 9 (ZNF9)

DISTROFIA MIOTONICA (DM2) • • • • •

Miotonia (alterato rilasciamento muscolare) Debolezza muscolare prossimo>distale e ipertrofia dei polpacci Ipotrofia associata a miotonia Cataratta Cardiomiopatia (difetti di conduzione, aritmie; cardiomiopatia dilatativa)

• • •

Atrofia gonadica, altri disturbi endocrinologici Ridotta tendenza all’anticipazione Elevata eterogeneita’ somatica

ATG

TAG

1

23 4

5

(CCTG)n 5’ UTR 11.3 kb gene; 1.5 kb mRNA

3’ UTR

Gene ZNF9; cromosoma 3q21.3

DISTROFIA MIOTONICA (DM2) (TG)n (TGTG)n (CCTG)n = range normale fino a 26 MUTAZIONE (CCTG)n : da 75 a 11,000 (CCTG)n (in media circa 5,000)

→ instabilita’ somatica e intergenerazionale

Eterogeneita’ somatica

Eterogeneita’ in gemelli

DM2 C. L. Liquori et al., Science 293, 864 -867 (2001)

Eterogeneita’ nel tempo

controllo

DM1

C. L. Liquori et al., Science 293, 864 -867 (2001)

ISTOPATOLOGIA DM2

H&E: Polidimensionalismo fibrale e rari nuclei centrali

ATPasi 9.4: Atrofia prevalente delle fibre di tipo II

SDH: Agglomerati di nuclei picnotici

DM1

DM2

• Distribuzione ipostenia – – – –

facciale, extraoculare distale agli arti prossimale agli arti atrofia muscolare

• Dolore muscolare • sistema nervoso centrale – – – –

ritardo mentale ipersonnia atrofia cerebrale lesioni della sostanza bianca

• malattie congenite • anticipazione genetica

++ ++ + ++

+ + ++ +

-

+

+ ++ + +

?

+ ++

-

MIOTONIA CONGENITA

MIOTONIA Distrofia miotonica (DM1)

DMPK

Distrofia Miotonia Miotonia miotonica Congenita di Becker (DM2)

ZNF9

Miotonia Paramiotonia aggravata dal Congenita Potassio

Canale del Canale del Canale del Cl- (CLCN1) Cl-(CLCN1) Na+ (SCN4A)

Canale del Na+ (SCN4A)

Canale del cloro muscolo scheletrico voltaggio-dipendente

CLCN1

Canale del cloro (CLCN1) • Ridotta conduttanza al cloro nelle cellule muscolari → ipereccitabilita’ della membrana (alterata ripolarizzazione) • Il canale del cloro e’ un omodimero. Ciascuna subunita’ forma un poro. Le mutazioni recessive agiscono con un meccanismo di “loss of function”, mentre le mutazioni dominanti agiscono con effetto “dominant-negative”

MIOTONIE CONGENITE • Caratterizzate da “senso di rigidita’” muscolare prevalente a carico degli arti inferiori • Miotonia piu’ evidente quando il movimento massimale avviene dopo il riposo • Fenomeno del “warming-up” (rigidita’ muscolare che migliora dopo un esercizio ripetuto) • Ipertrofia muscolare • Nelle forme recessive (miotonia di Becker) l’esordio e’ piu’ tardivo, la miotonia e’ piu’ grave e si possono associare a miopatia tardiva

Clinical Diagnosis of The Skeletal Muscle Chloride Ion Channelopathies

Inheritance Genetic defect

Thomsen’s Disease

Becker’s Myotonia

autosomal dominant (AD)

autosomal recessive (AR)

loss-of-function and dominant-negative mutations in the skeletal muscle voltage-gated chloride channel gene (CLCN1– Chr 7q35)

Age of onset

infancy to early childhood

late childhood to early teens

Areas affected

legs and hands

most muscles including facial muscles

Muscle hypertrophy

legs and trunk

legs

Lid lag

yes

yes

Grip myotonia

yes

yes

Percussion myotonia

yes

yes

EMG myotonia

yes

yes

Muscle weakness

no

yes

Severity

minimal to mildly affected

Provocative stimuli

prolonged rest, initiation of movement, or maintenance of the same posture

Warm-up phenomenon Therapy

yes

moderate to severely affected yes

mexiletine, quinine, procainamide, phenytoin

Canale del sodio voltaggiodipendente muscolo scheletrico

SCN4A

Membrane Topology of Voltage-Gated Sodium Channels •

•

The sodium channel Nav1.4 is made up of a principal pore forming and voltage sensitive subunit (α subunit) associated with an accessory β1 subunit. Mutations in sodium channel diseases are in the α subunit of Nav 1.4 encoded by the gene SCN4A located on chromosome 17q23-25

P-loop

Inactivation gate Frances M. Ashcroft. Ion Channels and Disease. Academic Press. 2000: 70

Gating Properties of Voltage-Sensitive Sodium Channel

SCN4A mutations cause a disruption of fast inactivation (gain of function mutations)

↓ Channel re-openings and Na+ accumulation

↓ Louis Ptacek. Am J Med 104:62, 1998

• •

Depolarization of muscle cells and generation of repetitive action potentials

Mild depolarization → long lasting hyperexcitability → MYOTONIA Strong depolarization → general opening of the the Na+ channel → PARALYSIS

Paramiotonia Congenita •

Von Eulenburg A (1886) Über eine familiare, durch 6 generationen verfolgbare form congenitaler paramyotonie. Neurologisches Centralblatt 12: 265-272

• Autosomica dominante con elevata penetranza • Esordio infantile • Miotonia paradossa • Stifness muscolare indotta dal freddo seguita da debolezza muscolare/paralisi

Clinical Diagnosis of The Skeletal Muscle Sodium Ion Channelopathies Paramyotonia Congenita (PC, PMC) Inheritance

autosomal dominant (AD)

Potassium-Aggravated Myotonia (PAM) autosomal dominant (AD)

Genetic defect missense mutations in the skeletal muscle voltage-gated sodium channel a-subunit gene (SCN4A—Chr 17q23-25) Age of onset

infancy to early childhood

Areas affected

facial, pharyngeal, distal

early childhood to second decade facial muscles, limbs

upper extremity muscles Attack duration

variable

variable

Paralysis severity

usually mild

never

Myotonia severity

mild to moderate

mild to severe

Myopathy

very rare

Provocative stimuli

cold, exercise, oral potassium

Therapy

acetazolamide, mexiletine,

rare oral potassium oral potassium, rest after exercise acetazolamide, mexiletine

tocainide, hydrochlorothiazide

Animal model Note

N/A

N/A myotonia fluctuans myotonia permanens acetazolamide-responsive myotonia painful myotonia