KRZYSZTOF KSIAZEK

Justyna Mikuła-Pietrasik

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro

Rozprawa doktorska

z Katedry i Zakładu Patofizjologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. med. Andrzej Bręborowicz Promotor: dr hab. n. med. Krzysztof Książek

Poznań 2011 r.

Justyna Mikuła-Pietrasik

Pracę tę dedykuję moim Najbliższym

2

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro.

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu dr hab. n. med. Krzysztofowi Książkowi za wprowadzenie mnie w ciekawą tematykę badań, opiekę merytoryczną, a także czas który mi poświęcił w trakcie realizacji niniejszej rozprawy. Dziękuję za ogromną życzliwość, wsparcie oraz motywowanie mnie przez cały czas trwania naszej współpracy.

3

Justyna Mikuła-Pietrasik

Dziękuję

Panu prof. dr hab. med. Andrzejowi Bręborowiczowi za umożliwienie mi przygotowania rozprawy doktorskiej w Katedrze i Zakładzie Patofizjologii. Panu dr hab. n. farm. Markowi Muriasowi z Katedry i Zakładu Toksykologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu za pomoc w przeprowadzeniu badań z wykorzystaniem metody HPLC oraz konsultację merytoryczną. Panu dr n. biol. Błażejowi Rubisiowi z Katedry i Zakładu Chemii Klinicznej i Diagnostyki Molekularnej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu za pomoc w oznaczeniu długości telomerowego DNA metodą ilościowego PCR. Pani dr n. biol. Katarzynie Piwockiej z Pracowni Cytometrii Instytutu Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie za pomoc w przeprowadzeniu badań z użyciem metody cytometrii przepływowej. Dziękuję także wszystkim współpracownikom z Katedry i Zakładu Patofizjologii za miłą atmosferę oraz wsparcie.

4

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro.

SPIS TREŚCI

Wykaz stosowanych skrótów.............................................................................................6 Streszczenie......................................................................................................................10 Summary..........................................................................................................................13 Wstęp...............................................................................................................................15 Cel pracy..........................................................................................................................37 Metodyka.........................................................................................................................38 Wyniki.............................................................................................................................54 Dyskusja..........................................................................................................................99 Wnioski.........................................................................................................................115 Piśmiennictwo...............................................................................................................116

5

Justyna Mikuła-Pietrasik

WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW 3,3’,4,4’-THS

3,3’,4,4’-tetrahydroksy-trans-stilben

3,3’,5,5’-THS

3,3’,5,5’-tetrahydroksy-trans-stilben

3,3’,4,4’,5,5’-HHS

3,3’,4,4’,5,5’-heksahydroksy-trans-stilben

X-Gal

5-bromo-4-chloro-3-indolo-β-D-galaktopiranozyd

8-OH-dG

8-hydroksy-2`-deoksyguanozyna

ΔΨm

potencjał wewnętrznej błony mitochondrialnej

AMPK

(AMP-activated protein kinase) - kinaza białkowa aktywowana przez AMP

ATM

(ataxia telangiectasia mutated) - kinaza białkowa zmutowana w zespole ataksji-teleangiektazji

AQP

(aquaporin) - akwaporyna

bp

(base pairs) - pary zasad

BSA

(bovine serum albumin) - albumina surowicy bydlęcej

CDK

(cyclin-dependent kinases) - kinazy zależne od cyklin

CPM

(counts per minute) - liczba impulsów przypadająca na 1 minutę pomiaru

COX

(cyclooxygenase) - cyklooksygenaza

CPD

(cumulative population doublings) - skumulowana liczba podwojeń populacji

DMSO

dimetylosulfotlenek

DAB

diaminobenzydyna

DAPI

4’,6’-diamidyno-2-fenyloindol

DHEA

dehydroepiandrosteron

EC-SOD

(extracellular superoxide dismutase) - zewnątrzkomórkowa izoforma dysmutazy ponadtlenkowej

ECM

(extracellular matrix) - macierz pozakomórkowa

EDTA

kwas etylenodiaminotetraoctowy

ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay) - płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej

eNOS

śródbłonkowa izoforma syntazy tlenku azotu

FACS

(fluorescence activated cell sorting) - cytometria przepływowa

6

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro.

FBS

(fetal bovine serum) - płodowa surowica bydlęca

FOXO

czynnik transkrypcyjny O z rodziny forkhead

GLUT

transporter glukozy

GPX

(glutathione peroxidase) - peroksydaza glutationu

GSH

glutation zredukowany

γ-H2A.X

ufosforylowany wariant histonu H2A.X

H2O2

nadtlenek wodoru

H2DCFDA

dwuoctanu 2’,7’-dichlorodihydrofluoresceiny

HBSS

(Hanks` balanced salt solution) - roztwór soli buforowany solami Hanksa

HMEC-1

(human microvascular endothelial cells) - komórki śródbłonka mikronaczyń skóry

KM

ludzkie komórki mezotelium otrzewnowego

HPLC

(high performance liquid chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa

HRP

(horseradish peroxidase) - peroksydaza chrzanowa

hTERT

katalityczna podjednostka telomerazy

HUVECs

(human umbilical vein endothelial cells) - komórki śródbłonka naczyniowego izolowane z krwi pępowinowej

IL

(interleukin) - interleukina

ICAM-1

(intercellular adhesion molecule) - cząsteczka adhezji międzykomórkowej

IGF-1

insulinopodobny czynnik wzrostu-1

JC-1

jodek 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraetylobenzymidazolokarbocyjaninowy

LDL

(low density lipoproteins) - lipoproteiny o niskiej gęstości

MCP-1

(macrophage chemoattractant protein-1) - białko chemotaktyczne monocytów-1

MnSOD

(manganese superoxide dismutase) - manganowa dysmutaza ponadtlenkowa

mtDNA

mitochondrialne DNA

MMP

(matrix metalloproteinase) - metaloproteinaza macierzy pozakomórkowej 7

Justyna Mikuła-Pietrasik

MUG

4-metyloumbelliferylo-β-D-galaktopiranozyd

MTT

formazan błękitu tiazolowego

NAO

N-nonyl oranż akrydyny

NBT

błękit nitrotetrazoliowy

NO

tlenek azotu

PA

(plasminogen activator) - aktywator plazminogenu

PAI

(plasminogen activator inhibitor) - inhibitor aktywatora plazminogenu

PCR

(polymerase chain reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy

PPAR

(peroxisome proliferator-activated receptors) - receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów

PBN

N-tert-butylo-D-fenylonitron

PBS

(phosphate buffered saline) - sól fizjologiczna buforowana fosforanami

PCNA

(proliferating cell nuclear antigen) - jądrowy antygen komórek proliferujących

PGC-1α

(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α) koaktywator receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów

PGE, PGI

prostaglandyny E, I

PI

(iodium propide) - jodek propidyny

RFT

reaktywne formy tlenu

SA-E-Gal

(senescence-associated E-galactosidase) - E-galaktozydaza związana ze starzeniem

SFM

(serum free media) - medium pozbawione surowicy

SIRT

sirtuiny

SDS

(sodium dodecyl sulfate) - sól sodowa siarczanu dodecylu

SOD

(superoxide dismutase) - dysmutaza ponadtlenkowa

t-BHP

hydronadtlenek-tert-butylu

TGF-E1

(transforming growth factor-E1) - transformujący czynnik wzrostu-E1

TIMP

(tissue inhibitor of metalloproteinase) - tkankowy inhibitor metaloproteinaz

TNFα

(tumor necrosis factor α) - czynnik martwicy nowotworów α

TRF

(telomere repeat factor) - czynnik powtórzeń telomerowych 8

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro.

TxB2

tromboksan B2

VEGF

(vascular endothelial growth factor) - czynnik wzrostu śródbłonka naczyń

VCAM-1

(vascular cell adhesion molekule-1) - cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka

9

Justyna Mikuła-Pietrasik

STRESZCZENIE Resweratrol (3,4’,5-trihydroksy-trans-stilben) jest naturalnie występującym polifenolem z grupy stilbenów, znanym z właściwości kardioprotekcyjnych, przeciwnowotworowych i przeciwzapalnych. W ostatnich latach dowiedziono, że wpływa on także na wydłużenie życia wielu organizmów modelowych, jak również wzrost możliwości proliferacyjnych komórek in vitro. Celem niniejszej rozprawy było określenie wpływu resweratrolu oraz jego trzech syntetycznych, dodatkowo hydroksylowanych pochodnych (3,3’,4,4’-tetrahydroksytrans-stilbenu,

3,3’,4,4’-THS;

3,3’,5,5’-tetrahydroksy-trans-stilbenu,

3,3’,4,4’,5,5’-heksahydroksy-trans-stilbenu,

3,3’,4,4’,5,5’-HHS)

na

3,3’,5,5’-THS; wykładniki

replikacyjnego starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego (KM) in vitro. Doświadczenia przeprowadzono na pierwotnych hodowlach KM, wyizolowanych z pobieranych śródoperacyjnie fragmentów sieci większej. Komórki eksponowane na związki badane w stężeniach 0,5 i 10 PM pasażowano w regularnych odstępach czasu, aż do wyczerpania ich aktywności podziałowej. W toku badań oceniono takie parametry, jak: proliferację komórek (m.in. ekspresję antygenu PCNA oraz dystrybucję komórek w cyklu mitotycznym), liczbę osiąganych podziałów, częstość występowania apoptozy (wielkość frakcji subG1, kondensacja chromatyny jądrowej), ekspresję markerów starzenia się (βgalaktozydazę związaną ze starzeniem; SA-β-Gal), produkcję reaktywnych form tlenu (RFT), aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), stopień oksydacyjnych uszkodzeń DNA (stężenie 8-hydroksy-2’-deoksyguanozyny; 8-OH-dG), masę mitochondriów, potencjał błony wewnętrznej mitochondriów, produkcję czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) i chemokiny CXCL8/IL-8 oraz zależną od KM proliferację komórek śródbłonka naczyniowego HMEC-1. Badania wykazały, że resweratrol oraz 3,3’,4,4’-THS zastosowane w stężeniu 0,5 μM w znaczący sposób zwiększają możliwości proliferacyjne KM in vitro, co stwierdzono zarówno w doświadczeniach ostrych (m.in. na podstawie wzrostu ekspresji antygenu PCNA oraz wzrostu odsetka komórek w fazie S cyklu), jak również na podstawie oceny osiąganej przez komórki liczby podziałów. Efekt ten szedł w parze ze zmniejszeniem ekspresji i aktywności SA-β-Gal. W przypadku 3,3’,5,5’-THS oraz 3,3’,4,4’,5,5’-HHS zaobserwowano, że pomimo pobudzenia proliferacji komórek w systemie ostrym, związki te nie wpływają na wzrost osiąganej przez komórki liczby podziałów. Dodatkowo 3,3’,4,4’-

10

Wpływ stilbenów (resweratrolu i jego analogów) na molekularne i czynnościowe wykładniki starzenia się ludzkich komórek mezotelium otrzewnowego in vitro.

THS

oraz

3,3’,4,4’,5,5’-HHS

użyte

w

stężeniu

10

PM

wywierały

działanie

antyproliferacyjne w eksperymentach przewlekłych. Przeprowadzone badania dowiodły także, że obserwowane zmiany w proliferacji komórek pod wpływem resweratrolu oraz 3,3’,4,4’-THS przebiegały w sposób niezależny od zmian długości telomerowego DNA, jak również nie były związane ze zmianami częstości występowania apoptozy. Wzrost wielkości frakcji komórek zawierających niskocząsteczkowe DNA (frakcji subG1) odnotowano tylko w przypadku 3,3’,4,4’-THS oraz 3,3’,4,4’,5,5’-HHS użytych w stężeniu 10 PM. Poprawie możliwości proliferacyjnych komórek pod wpływem resweratrolu oraz 3,3’,4,4’-THS towarzyszył trwały wzrost aktywności SOD  być może będący odpowiedzią na silny, lecz krótkotrwały wzrost produkcji RFT  oraz obniżenie stężenia 8-OH-dG. W przypadku 3,3’,5,5’-THS oraz 3,3’,4,4’,5,5’-HHS pobudzenie aktywności SOD było zdecydowanie mniejsze i tylko chwilowe, a stopień uszkodzeń DNA w komórkach młodych był porównywalny z grupą kontrolną, natomiast w komórkach starych był istotnie wyższy. Oceniając metabolizm mitochondriów stwierdzono, że resweratrol oraz 3,3’,4,4’-THS powodują nasilenie biogenezy tych organelli w komórkach młodych, czemu towarzyszyło obniżenie wartości potencjału ich błony wewnętrznej. Z kolei 3,3’,5,5’-THS pobudzał biogenezę mitochondriów w komórkach młodych, a obniżał w starych, przy jednoczesnym wzroście potencjału ('