quantificazione e purezza dell`rna

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DELL’RNA TOTALE DA LINFOCITI DI SANGUE PERIFERICO.

I campioni di sangue sono raccolti in quantità opportune, in provette con EDTA e mantenuti a 4°C. Dopo stratificazione su Fycoll-Hystopaque, si preleva l’anello linfomonocitario e si effettuano 2 lavaggi in PBS in modo da poter procedere alla lisi cellulare. A tale scopo si utilizza una soluzione monofasica di fenolo acido e guanidinio isotiocianato (“Trizol reagent”, Invitrogen Life technologies), seguita da estrazione con cloroformio. Dopo precipitazione con etanolo assoluto, l’RNA totale viene purificato su colonna RNeasy midi (“Rneasy midi kit”, Qiagen), quindi nuovamente precipitato. Il pellet viene poi lavato 2 volte con etanolo 75%, risospeso in acqua Rnase free ad una concentrazione pari a circa 1 mg/ml, e conservato a –80°C. QUANTIFICAZIONE E PUREZZA DELL’RNA

La concentrazione e la qualità dell’RNA viene determinata mediante Bioanalyser Agilent 2100 secondo la procedura fornita dal RNA 6000 Nano Assay Kit (Agilent Technologies), specifico per la valutazione dell’RNA totale eucariotico. Ogni RNA LabChip è costituito da un set di microcapillari nei quali viene polimerizzato un gel per la separazione dei frammenti di acido nucleico. Il software del Bioanalyser traccia per ciascun campione un profilo elettroforetico da cui ricava la concentrazione e la qualità dell’acido nucleico misurando il rapporto delle aree dei picchi corrispondenti all’RNA ribosomale 28S e 18S. MARCATURA DI cDNA CON Cy3 e Cy5

20 µg di RNA totale vengono marcati con Cy3-dCTP e Cy5-dCTP tramite una procedura diretta, che prevede l’incorporazione dei fluorocromi durante la reazione di retrotrascrizione (Direct Labeling cDNA Synthesis kit, Agilent). Al termine dell’incubazione, si inattiva la retrotrascrittasi e l’RNA residuo viene degradato incubando in presenza di Rnasi IA. Per eliminare i nucleotidi fluorescenti non incorporati, che aumenterebbero significativamente la fluorescenza di fondo dell’array, si utilizzano colonne cromatografiche QIAquick Spin Columns, Qiagen, da cui il DNA viene poi eluito con tampone. IBRIDAZIONE DEL cDNA MARCATO

Si utilizzano vetrini Agilent Human 1A Oligo DNA Microarrays. Ogni array comprende 22.575 oligonucleotidi 60-mer rappresentativi di 17.803 geni umani appartenenti al Genomics Foundation Database della Incyte. Il campione marcato viene denaturato e si procede all’aggiunta di Control Targets, costituito da oligonucleotidi marcati con Cy3 che ibridano con alcuni spot posti ai limiti dell’array, utilizzati per orientare l’immagine e Hybridization Buffer (Agilent). Dopo aver assemblato il vetrino nella camera di ibridazione, si aggiunge la miscela di cDNA marcato, e si incuba 16-17 ore all’interno di un forno da ibridazione a 60°C su supporto girevole. La soluzione di ibridazione in eccesso viene eliminata con una soluzione a bassa stringenza e, a seguire, con un lavaggio ad alta stringenza. Il vetrino viene poi asciugato in atmosfera di azoto in modo da poterlo leggere allo scanner. SCANSIONE DELLA SLIDE E ANALISI DEI DATI

Per la scansione si utilzza uno Scanner Agilent (G2565AA), a doppio laser fornito di sitema di autofocusing dinamico per l’analisi d’immagine ad alta risoluzione . Il software di Feature Extraction opera una prima analisi dei dati e valuta espressioni diffrenziali calcolando un valore di log ratio tra i segnali nei due canali associato a un p-value.