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Aprile-Giugno 2014 • Vol. 44 • N. 174 • Pp. 72-80

Ematologia Pediatrica

Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso Immacolata Andolfo1,2, Roberta Russo1,2, Achille Iolascon1,2

CEINGE - Biotecnologie Avanzate, Napoli Dipartimento di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche, Università “Federico II”, Napoli

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Riassunto La membrana dell’eritrocita è una delle più conosciute in termini di struttura, funzione e disordini genetici correlati. La maggior parte delle proteine di membrana del globulo rosso (GR) sono state studiate in grande dettaglio e anche i geni responsabili delle patologie di membrana correlate sono ad oggi noti. I disordini legati a difetti della membrana del GR comprendono un gruppo piuttosto eterogeneo di patologie ereditarie legate ad alterazioni a carico di varie proteine di membrane o del citoscheletro del GR, con conseguente diminuzione della deformabilità eritrocitaria, ridotta emivita e prematura rimozione degli eritrociti dal circolo. Tale gruppo di disordini include: sferocitosi ereditaria (HS), ellissocitosi ereditaria (HE), piropoichilocitosi ereditaria (HPP), ovalocitosi del sud-est asiatico (SAO), stomatocitosi ereditaria deidrata (DHSt) ed overidrata (OHSt), pseudoiperkalemia familiare (FP), crioidrocitosi ereditaria (CHC). In questa review riassumeremo i progressi fatti nella conoscenza delle patologie di membrana del GR, ed in particolare descriveremo: i) organizzazione strutturale della membrana eritrocitaria; ii) interazione tra le varie proteine di membrane e citoscheletriche e i difetti associati ad esse; iii) metodologie, compresa l’analisi genetica, che consentono la diagnosi di vari disturbi della membrana eritrocitaria.

Summary The red cell membrane is one of the best known membranes in terms of structure, function and genetic disorders. The majority of the red blood cell membrane proteins has been studied in great detail and also the genes responsible for diseases related to membrane are actually known. The disorders associated with defects in the membrane of the red blood cell comprise an heterogeneous group of inherited diseases related to alterations in several membrane proteins or in proteins of the cytoskeleton of the red blood cell, resulting in decreased erythrocyte deformability, reduced half-life and premature removal of erythrocytes from circle. This group of disorders includes: Hereditary Spherocytosis (HS), Hereditary Elliptocytosis (HE), Hereditary Pyropoikilocytosis (HPP), South East Asian Ovalocytosis (SAO), Dehydrated hereditary stomatocytosis (DHSt), Overhydrated Hereditary Stomatocytosis (OHSt), Familial Pseudohyperkalemia (FP), Cryohydrocytosis (CHC). In this review, we will summarize the substantial progress that has been made in our understanding of membrane defects of red blood cells: i) structural organization of the erythrocyte membrane including the complete characterization of a large number of membrane proteins, ii) structural basis for the interactions between various membrane and cytoskeletal proteins and defects of these interactions due to mutations in genes that encode the various proteins leading to defective membrane function; iii) appropriate methodologies including genetic analysis that allows the diagnosis of various disorders of the erythrocyte membrane. Parole chiave: Disordini legati a difetti della membrana del GR; Anemia; Diagnosi molecolare Key words: Red blood cell membrane-related disorders; Anemia; Molecular diagnosis

Metodologia di ricerca bibliografica La ricerca degli articoli rilevanti è stata effettuata tramite la banca bibliografica PubMed, utlizzando come parole chiave: “membrane defects of red blood cells”, “Hereditary Spherocytosis, (HS)”, “Hereditary Elliptocytosis, (HE)”, Hereditary Pyropoikilocytosis, (HPP)”, “South East Asian Ovalocytosis, SAO”, “Xerocytosis”, “Dehydrated Hereditary Stomatocytosis, (DHSt)”, “Overhydrated Hereditary Stomatocytosis, (OHS)”, “Familial Pseudohyperkalemia, (FP)”, “Cryohydrocytosis, (CHC)”.

Introduzione I disordini legati a difetti della membrana del globulo rosso (MGR) sono un gruppo eterogeneo di patologie ereditarie dovute ad alterazioni a carico di proteine di membrana o del citoscheletro del GR,

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con conseguente ridotta deformabilità e prematura rimozione degli stessi dal circolo. Il sospetto di una patologia della MGR viene posto in presenza di un quadro clinico di anemia emolitica, di vario grado, ben compensata, previa esclusione di altre cause: anemie autoimmuni, da deficit enzimatici, anemie iporigenerative, da alterata sintesi globinica. L’iter diagnostico prevede il susseguirsi di indagini di primo, secondo e terzo livello (Fig. 1). Studi estensivi sulla MGR hanno permesso di conoscerne in dettaglio le funzioni e la struttura. La base molecolare della stragrande maggioranza di casi di alterazione della MGR (sferocitosi ereditaria [HS], ellissocitosi [HE], ovalocitosi [SAO]) sono stati completamente definiti. Per quanto riguarda le basi molecolari dei disordini legati all’alterata permeabilità della MGR (stomatocitosi ereditarie), durante lo scorso anno sono stati identificati i geni causativi sia della forma deidrata che della pseudoiperkalemia familiare.

Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso

Figura 1. Diagramma di flusso per la diagnosi delle anemie ereditarie legate a difetti della MGR. Sono rappresentati i principali step che consentono la diagnosi differenziale.

La membrana del globulo rosso: proteine integrali di membrana e loro interazioni con il citoscheletro La caratteristica più importante della MGR è la deformabilità: durante i suoi 120 giorni di vita, il GR subisce deformazioni passive al fine di circolare attraverso la fitta rete di capillari del microcircolo (Iola-

scon et al., 2010). La MGR è composta da un doppio strato lipidico costituito da fosfolipidi e colesterolo, in cui sono immerse le proteine trans-membrana (PTM) (Fig. 2). Queste ultime funzionano da ancora per il citoscheletro, un network bidimensionale di proteine responsabile dell’elasticità e flessibilità del GR (An e Mohandas, 2008). Una caratteristica peculiare della MGR è la distribuzione asimmetrica dei fosfolipidi; ad esempio, fosfatidilcolina e sfingomielina predominano nel foglietto esterno, laddove fosfatidiletanolammina (PE) e fosfatidelserina (PS) in quello interno (Zwaal e Schroit, 1997). La distribuzione asimmetrica dei fosfolipidi assume una rilevanza funzionale, poiché la PS interagisce con proteine del citoscheletro, quali la spettrina e la proteina 4.1, ancorando il citoscheletro al doppio strato lipidico. Come tutte le membrane plasmatiche, la MGR media le funzioni di trasporto; sono state, infatti, identificate più di 50 PTM con funzione di trasporto di ioni e di piccole molecole organiche. Le PTM, tuttavia, possono anche fungere da antigeni, attraverso i glicani a loro legati, come quelli dei gruppi sanguigni (antigeni del gruppo AB0), oppure svolgere il ruolo di adesione cellulare con altre cellule del sangue o con cellule endoteliali (Reid e Mohandas, 2004). Le PTM rilevanti per l’integrità strutturale sono la banda 3 (scambiatore anionico, la proteina più abbondante nella MGR), la glicoforina C e l’RhAG, che legano il doppio strato lipidico al citoscheletro (spettrina) tramite l’anchirina, le prime due, e tramite la proteina 4.1, la terza (Bennett et al., 1983; Nicolas et al., 2003; Marfatia et al., 1995). Banda 3 e RhAG sono PTM con funzione di trasportatori di anioni e gas (Iolascon et al., 2003). Le principali proteine che compongono il network del citoscheletro sono: spettrina α- e β- (le più abbondanti, circa 20-30%), actina, proteina 4.1, adducina, dematina, tropomiosina e tropomodulina (Mohandas e Reid, 2006). La caratteristica peculiare del lungo filamento di spettrina è una ripetizione di 106 amminoacidi presenti in tripla elica, 21 nell’α-spettrina e 15 nella β- (Yan et al., 1993). Le

Figura 2. Rappresentazione schematica della membrane del globulo rosso. La membrana del globulo rosso è composta da un doppio strato fosfolipidico (indicato in celeste) con le proteine TM che lo attraversano. Il network di proteine del citoscheletro si ancora alla membrana tramite le proteine TM.

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I. Andolfo et al.

due spettrine formano un eterodimero anti-parallelo attraverso le interazioni laterali tra regione C-terminale dell’α-spettrina con regione N-terminale della β-spettrina (Ursitti et al., 1996). Il dimero di spettrina è regolato dinamicamente nel GR e la perdita di questa interazione si esplica nella diminuzione della stabilità meccanica (An et al., 2002). L’altra parte del dimero di spettrina forma un complesso giunzionale con l’actina e la proteina 4.1R (An et al., 2005). Il complesso ternario di spettrina-actina e proteina 4.1 è un regolatore critico dell’integrità meccanica della MGR (Fig. 2).

Patologie di membrana del globulo rosso: epidemiologia, presentazione clinica, indagini di primo livello Sferocitosi ereditaria La sferocitosi ereditaria (HS) è la più comune patologia di membrana del globulo rosso, nonché la causa più comune di anemia emolitica non-immune nella popolazione caucasica, con una prevalenza stimata tra 1:2000 e 1:5000 (Delaunay, 2007). I principali segni sono: anemia emolitica normocitica di grado variabile, aumento della percentuale di cellule iperdense (Hb>41g/dL) aumento della concentrazione media di Hb corpuscolare (MCHC) >36 g/dL, reticolocitosi, ittero, splenomegalia e colelitiasi. Nelle forme più comuni essi compaiono una o due settimane dopo la nascita.

Nei primi mesi di vita la situazione può peggiorare temporaneamente a causa della ridotta attività eritropoietica, determinando un bisogno trasfusionale. Lo stato clinico tende poi a migliorare. L’HS presenta elevata variabilità fenotipica; il quadro clinico copre, infatti, un’ampia gamma di manifestazioni, da casi con idrope fetale a quelli asintomatici. Può essere classificata in lieve, moderata, moderatamente grave e grave in relazione ad alcuni parametri, come emoglobina (Hb) e conta reticolocitaria. Circa il 20% dei pazienti presenta una HS lieve, con emolisi compensata, livelli di Hb pressoché normali, lieve reticolocitosi (< 6%) e splenomegalia. La maggior parte dei pazienti di questo gruppo sfugge alla diagnosi fino all’età adulta, allorquando si manifestano complicazioni legate all’emolisi cronica, come la calcolosi biliare. La quota più numerosa di pazienti (60% dei casi) rientra nella HS di grado moderato, con livelli di Hb compresi tra 8.0-11.0 g/dL e reticolocitosi marcata (> 8%). Una minoranza di pazienti (10%), definiti HS moderatamente gravi, esibisce valori piuttosto bassi di Hb (6.0-8.0 g/dL), grave reticolocitosi (> 15%) e la necessità di trasfusioni intermittenti. Infine, circa il 3-5% dei pazienti presenta anemia grave con fabbisogno regolare di trasfusioni (An e Mohandas, 2008). Una storia familiare di HS, splenectomia, e colecistectomia aiutano nella diagnosi, poiché gli sferociti sono spesso presenti anche in casi di anemia emolitica autoimmune. Gli sferociti sono il risultato di una riduzione del rapporto tra superficie e volume, correlato alla perdita di MGR a causa dell’alterata interazione tra fosfolipidi di membrana

Tabella I. Diagnosi differenziale dei difetti di membrana del globulo rosso. Patologia (acronimo)

Indici eritrocitari

Analisi morfologica dello striscio di sangue periferico

Indici biochimici

Ectacitometria Forma curva

§

§

§

DImax

O’

Omin point

Sferocitosi ereditaria (HS)

MCV normale MCH aumentato MCHC aumentato

Sferociti, policromatofilia GR a funghetto

OF ridotto AGLT50 ridotto PT ridotto EMA ridotto

Stessa forma di un CTR ma spostata a dx

Dimuito

Spostato a sn

Spostato a dx

Ellissocitosi ereditaria (HE)

MCV normale MCHC aumentato nei casi gravi

Ellissociti, sferociti, stomatociti, cellule frammentate, poichilocitosi

OF può essere aumentato nei casi gravi

Forma trapeiziodale

Dimuito

Normale

Normale

Piropoichilocitosi ereditaria (HPP)

MCV diminuito

ellissociti e GR frammentati

Nd

Forma trapezioidale

Molto Spostato a sn diminuito

Spostato a sn

Ovalocitosi del sud-est MCV normale asiatico (SAO) MCH normale

Ovalociti con fessura intracitoplasmatica

Nd

Forma appiattita verso il basso

Quasi 0

Spostato a sn o quasi uguale al CTR

Spostato a sn

Stomatocitosi ereditaria deidrata (DHSt)

MCV aumentato MCHC aumentato

Stomatociti (36 g/dL) ed il profilo di deformabilità all’ectacitometria è spostato verso sinistra con una DImax normale ed i parametri Omin e Hyper point ridotti, indicando appunto disidratazione (Delaunay, 2007) (Tab. I, Fig. 4). Allo striscio gli stomatociti, emazie con il caratteristico alone centrale a forma di bocca, sono piuttosto rari, rendendo la diagnosi spesso difficile. Inoltre, quest’ultima può risultare difficoltosa quando il quadro clinico si associa a pseudoiperkaliemia e/o edema perinatale, nella forma denominata sindrome pleiotropica (Delaunay, 2004). Per tali motivi, la condizione può essere trascurata per anni o decenni prima di raggiungere una diagnosi conclusiva. La pseudoiperkalemia consiste nell’aumento della kalemia quando il prelievo di sangue periferico è esposto a temperature inferiori a quella corporea. L’edema pre/perinatale è un edema di tipo chiloso, spesso già visibile tramite ecografia in epoca gestazionale e presente alla nascita. Nei casi più gravi l’edema richiede interventi di drenaggio, in altri casi si risolve spontaneamente entro pochi mesi di vita. L’OHSt è molto rara (20 casi segnalati in tutto il mondo). Contrariamente alla DHSt, i GR vengono idratati a causa di un aumento, da 20 a 40 volte, nella perdita di cationi (Stewart, 2004). L’OHSt si associa a fenotipi più gravi, rispetto alla DHSt. Oltre alla reticolocitosi, è caratterizzata da un forte aumento dell’MCV (>110 fL) e diminuzione dell’MCHC (24-30 g/dl) con uno spostamento verso destra del profilo della curva ectacitometrica (Fig. 4). Il numero di stomatociti allo striscio è, di solito, molto più alto di quello osservato nella DHSt (Fig. 3). Forme aggiuntive di stomatocitosi sono la pseudoiperkalemia familiare isolata (FP) e la crioidrocitosi (CH). La FP non è associata ad anemia emolitica e allo striscio sono osservabili rari stomatociti. Al contrario, nella CHC i pazienti mostrano un’anemia emolitica di grado variabile. I GR di pazienti con FP mostrano una perdita di K+ a basse temperature (