Wpływ zróżnicowanego zasolenia wody oraz soli biogenicznych

Wpływ zróżnicowanego zasolenia wody oraz stężenia soli biogenicznych zawierających fosfor, azot i krzem na liczebność populacji Heterosigma akashiwo, oraz ocena stopnia adaptacji tego glonu w warunkach wód Morza Bałtyckiego.

Autor: Magdalena Kownacka Klasa: IIIE Opiekun: mgr Katarzyna Kudela Szkoła: XIV Liceum Ogólnokształcące w Gdyni

Streszczenie Celem przeprowadzonych doświadczeń było zbadanie wpływu zróżnicowanego zasolenia wody oraz rozpuszczonych w niej soli biogenicznych zawierających fosfor, azot i krzem na liczebność populacji Heterosigma akashiwo oraz próba oceny adaptacji tego glonu do warunków fizyczno - chemicznych wód Bałtyku Południowego. Badania przeprowadziłam w laboratorium Morskiego Instytutu Rybackiego – Państwowego Instytutu Badawczego w Gdyni. Biorąc pod uwagę wyniki doświadczenia, można wywnioskować, że: 1) największe tempo wzrostu H. akashiwo zanotowano w próbie hodowanej na pożywce, w której sole biogeniczne zostały dodane w stosunku Redfield’a. Natomiast najniższe tempo wzrostu zanotowano w pożywce bez azotu, co świadczy o tym, że optymalne warunki dla wzrostu liczebności H. akashiwo stwarza podłoże przygotowane w proporcji Redfield’a, zaś najbardziej istotnym czynnikiem dla wzrostu populacji H. akashiwo jest wysoka zawartość azotanów w środowisku; 2) w wodzie o temperaturze 15°C optymalnym zasoleniem dla rozwoju H. akashiwo jest 36 psu, przy którym zaobserwowano najwyższą liczebność populacji badanego glonu; 3) w Zatoce Gdańskiej znajdują się warunki mogące stymulować wzrost H. akashiwo.

Wstęp Heterosigma akashiwo (Y.Hada) Y.Hada ex Y.Hara & M.Chihara, 1987 jest morskim przedstawicielem klasy Raphidophyceae, gromady Heterokontophyta [3]. Gatunek ten charakteryzuje się tym że, niektóre jego szczepy są tolerancyjne na szeroki zakres zasolenia, temperatury i oświetlenia wody, natomiast inne są wrażliwe na takie czynniki jak niska temperatura czy słabe oświetlenie. Spowalniają one lub całkowicie hamują rozwój tych szczepów [5]. H. akashiwo występuje w wodach przybrzeżnych klimatu tropikalnego i umiarkowanego (rys.1[9]), między innymi u wybrzeży Japonii, Nowej Zelandii, południowej Australii, południowo-zachodnich wybrzeży Afryki, Florydy, w Zatoce Biskajskiej w estuarium rzeki Nervion, w północnej Hiszpanii, u wybrzeży Norwegii, w Cieśninach Duńskich[5][10]. Glon powoduje toksyczne zakwity, których skutkiem jest masowe śnięcie ryb [5]. Długość komórki wynosi 18-28µm, a szerokość 12-18µm [1][3], (zdjęcie 1). Jest autotroficzną monadą posiadającą od 10 do 25 żółto-brązowych, dyskoidalnych chloroplastów umieszczonych na obrzeżach komórki oraz dwie wicie równej długości umożliwiające szybkie pływanie i nagłą zmianę kierunku poruszania oraz ruch obrotowy wokół własnej osi[3]. W niesprzyjających warunkach komórki mogą formować cysty. W środowiskach naturalnych czynnikami powodującymi degradację zakwitów H. akashiwo są zarówno nagłe zamiany w fizycznych parametrach wody, jak również wyżeranie ich przez orzęski i bruzdnice, a także ataki bakterii i wirusów [5]. Zbadałam wpływ zasolenia w zakresie 0-36 psu oraz różnego stężenia soli azotu, fosforu i krzemu na rozwój H. akashiwo. Dokonałam oceny stopnia adaptacji tego glonu w warunkach wód Morza Bałtyckiego, znajdujących się wzdłuż polskiej linii brzegowej.

Zdjęcie autora 1- komórki H.akashiwo zakonserwowane płynem Lugola.

Materiały i metody Praca badawcza obejmowała dwa doświadczenia: Doświadczenie 1. Badanie tempa wzrostu Heterosigma akashiwo w wodzie o różnym zasoleniu. 1. Kolejne etapy przygotowania pożywek o różnym zasoleniu : 1. W wodzie destylowanej rozpuszczono sztuczną sól morską, aby otrzymać następujące zasolenia: 0; 7; 20; 30 i 36 psu. Po przygotowaniu tych roztworów sprawdzono wielkość zasolenia konduktometrem cc-401 Elmetron.

2. Podłoże bałtyckie przygotowano na bazie naturalnej wody morskiej pochodzącej z Zatoki Gdańskiej (pobranej z okolic bulwaru gdyńskiego), która została przepuszczona przez filtr o średnicy porów 0.2µm w celu usunięcia wszelkich organizmów i zanieczyszczeń.

3. Do pojemników z wodą o różnym zasoleniu dodano pożywkę f/2 zawierającą w swoim składzie roztwory soli biogenicznych (18N:P:3Si)[2], metali śladowych i witamin. Każdy wariant podłoża przepuszczono przez filtr o średnicy 0.2µm do wysterylizowanych litrowych butelek.

2. Zaszczepienie hodowli H. akashiwo odbyło się pod komorą laminarną .W tym celu do trzech naczyń hodowlanych nalano po 20 ml z każdego wariantu pożywki i zaszczepiono je 2 ml wody, w której znajdowało się 68*106 komórek z hodowli macierzystej. Następnie zaszczepione pożywki inkubowano przez 20 dni w temperaturze 15°C i przy oświetleniu 5-16µEinstein*sek-1*m-2 w cyklu 12 godzin jasnych i 12 godzin ciemnych. Dla każdej próby badawczej wykonano po trzy powtórzenia. 3. Liczenie komórek odbywało się pod mikroskopem świetlnym Nikon Eclipse 80i za pomocą hemocytometru, co drugi dzień hodowli. Aby policzyć komórki, unieruchomiono je płynem Lugola. Doświadczenie 2. Badanie tempa wzrostu Heterosigma akashiwo przy różnych stężeniach soli biogenicznych. W celu przeprowadzenia doświadczenia 2 na bazie roztworu o zasoleniu 30 psu przygotowano 8 wariantów podłoża, różniących się od siebie stężeniem soli biogenicznych PODŁOŻA 1 1 Próba kontrolna 1 => na pożywce

2 2

f/2 (wykonanej bez według recepty azotu Guillard& Ryther ` (1962)[2])

3

4

5

Próby badawcze na bazie pożywki f/2 2

bez fosforu

2

bez krzemu

2

dodano 2x więcej azotu

6 2

dodano 2x więcej fosforu

7

8

Substraty zostały dodane według stosunku Redfield’a [8] 2

16N : P : 15Si

2

ale bez krzemu (16N : P)

W badaniu do 10 ml pożywki dodano 1.6 ml wody w której było 30*106 komórek z hodowli macierzystej, a czas inkubacji (przeprowadzonej w tych samych warunkach temperatury i oświetlenia jak w doświadczeniu 1) trwał 14 dni. Zaszczepianie hodowli i liczenie komórek odbyły się podobnie jak w doświadczeniu 1 Dla każdej próby badawczej wykonano trzy powtórzenia. Tempo wzrostu w obu doświadczeniach liczono według wzoru [4]: Ke=ln(N1//N0)/ t1 – t0, w którym: * Ke - tempo wzrostu [d-1] * N0 - liczba komórek dnia poprzedniego * N1 - liczba komórek dnia następnego * t1 - czas [dzień następny] * t0 - czas [dzień poprzedni] Przeliczenia i wykresy wykonano za pomocą programu Microsoft Office Excel 2007. Badane okazy Heterosigma akashiwo zostały udostępnione przez Morski Instytut Rybacki Państwowy Instytut Badawczy w Gdyni i pochodzą z kolekcji Scandinavian Culture Collection of Algae & Protozoa. Hodowany szczep wywodzi się z północno-wschodnich wybrzeży Danii, z okolic portu Aarhus. Pracę wykonywałam w laboratorium MIR - PIB, korzystałam z konsultacji z panią mgr Janiną Kownacką.

ilość komórek w 1ml (*106)

Wyniki z doświadczenia 1 Wpływ zasolenia na rozwój Heterosigma akashiwo. Średnia liczebność komórek ± odchylenie standardowe (n=3). Wykres 1. Od dnia zero do dnia szóstego liczba Wykres 1 komórek glonu spada, osiągając zero w ósmym 0 psu 30 psu - próba kontrolna dniu.

80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

20

dzień hodowli

ilość komórek w 1ml (*106)

Wykres 2 80

7 psu podłoże sztuczne

podłoże bałtyckie

30 psu - próba kontrolna

60 40

Zdjęcie autora 2- komórki H.akashiwo w zasoleniu 0 psu po 2 i 6 dniach.

Wykres 2. W obydwu próbach badawczych przedstawionych na wykresie początkowe zagęszczenie komórek jest większe od ich zagęszczenia w ostatnim dniu doświadczenia. Tempo wzrostu w próbie badawczej hodowanej na podłożu bałtyckim jest wyższe (wynosi -0,01d-1) od tempa wzrostu w próbie badawczej hodowanej na podłożu sztucznym (wynosi -0,63d -1) . Zdjęcie autora 3komórki H.akashiwo w zasoleniu 7 psu po 2 dniach

20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

20

ilość komórek w 1ml (*106)

dzień hodowli

Wykres 3

80

20 psu

Wykres3. Na początku doświadczenia zagęszczenie populacji H. akashiwo maleje; wzrasta dopiero od szóstego dnia. Populacja H. akashiwo lepiej rozwija się w próbie kontrolnej niż w próbie o zasoleniu 20 psu.

30 psu - próba kontrolna

60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

20

dzień hodowli ilość komórek w 1ml (*106)

Zdjęcie autora 4- komórki H.akashiwo w zasoleniu 30 psu po 2., 6, 12 dniach

Wykres 4. 2, 10, 12, 16 dnia zagęszczenie hodowli o zasoleniu 36 psu było większe niż w próbie kontrolnej, poza tym średnie tempo wzrostu populacji H. akashiwo okazało się wyższe niż w zasoleniu 36 psu (0.106d-1) i wyższe niż w próbie kontrolnej (0.067d-1).

Wykres 4

100

36 psu

30 psu - próba kontrolna

80 60 40 20 0

0Wyniki 2 doświadczenia 4 6 8 2.10

12

14

16

20

dzień hodowli

Zdjęcie autora 5- komórki H.akashiwo w zasoleniu 36 psu po 2, 4., 12 dniach

Wyniki z doświadczenia 2 Rozwój Heterosigma akashiwo na pożywkach o różnym stężeniu soli biogenicznych. Średnia liczebność komórek ± odchylenie standardowe (n=3).

Wykres 5 2,5E+09

f/2 - próba kontrolna

Red

Red bez Si

bez Si

ilość komórek w 1ml

2,0E+09 1,5E+09 1,0E+09 5,0E+08 0,0E+00 0

2

4

6

8

10

12

14

Wykres 5. Najwyższe tempo wzrostu populacji zanotowano w próbie hodowanej na pożywce, w której substraty zostały dodane w stosunku Redfield’a, bez krzemu (Red bez Si) i wynosiło ono 0,15d-1. Najniższe tempo wzrostu (0.09d-1) zanotowano w próbie hodowanej na standardowej pożywce f/2 bez krzemu (bez Si). Na wykresie we wszystkich analizowanych wariantach liczba komórek odnotowana ostatniego dnia doświadczenia jest większa od liczby w dniu zero.

dzień hodowli

Wykres 6

3,5E+09

f/2 - próba kontrolna

bez N

2x N

ilość komórek w 1ml

3,0E+09 2,5E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,0E+09 5,0E+08 0,0E+00 0

2

4

6

8

10

12

14

Wykres 6. W hodowli na pożywce z podwójną ilością azotu (2xN) w porównaniu z próbą kontrolną jest od 0.7 do 3.6 razy więcej osobników. W populacji, która rośnie na pożywce bez azotu (bez N), jest mniej osobników niż w populacji hodowanej na pożywce f/2 i w populacji rosnącej na pożywce z podwójnym azotem. Wyjątek stanowi dzień 2. i 6., ponieważ w tym czasie liczba komórek w próbie (bez N) jest większa od ilości w próbie kontrolnej.

dzień hodowli Wykres 7. W hodowli na pożywce z podwójną ilością fosforu (2xP) w porównaniu z pożywką f/2 rośnie zagęszczenie osobników w kolejnych dniach hodowli i jest ono większe niż w próbie kontrolnej aż do dnia 12. Zaś 14. dnia hodowli zagęszczenie komórek w próbie (2xP) gwałtownie spada i jest mniejsze niż w próbie kontrolnej. W każdym wariancie końcowa liczba komórek jest większa od ilości w dniu zero.

Wykres 7

3,5E+09

f/2 - próba kontrolna

bez P

2x P

ilość komórek w 1ml

3,0E+09 2,5E+09 2,0E+09 1,5E+09. 1,0E+09 5,0E+08 0,0E+00 0

2

4

6

8

10

12

14

dzień hodowli

Dyskusja Heterosigma akashiwo (Y.Hada) Y.Hada ex Y.Hara & M.Chihara, 1987 jest morskim przedstawicielem klasy Raphidophyceae gromady Heterokontophyta. Występuje w wodach przybrzeżnych klimatu tropikalnego i umiarkowanego. Hodowany szczep, na którym wykonano doświadczenie, pochodzi z północno-wschodnich wybrzeży Danii, z okolic portu Aarhus, gdzie zasolenie wody wynosi w granicach od 20 do 26 psu, a panujący klimat jest umiarkowany [6]. W pracy badawczej nad tym gatunkiem glona przeprowadzono dwa doświadczenia. Pierwsze z nich dotyczyło badania wzrostu liczebności H. akashiwo w różnym zasoleniu wody. W pierwszej próbie badawczej H. akashiwo była hodowana w wodzie o zasoleniu 0 psu na pożywce f/2, w której stosunek azotu do fosforu do krzemu wynosi 18:1:3. (wykres1). W tym zasoleniu komórki uległy całkowitej destrukcji na skutek znalezienia się w środowisku hipotonicznym. Woda napływająca na zasadzie osmozy ze środowiska do komórki spowodowała plazmolizę, która następnie doprowadziła do rozerwania komórek, co widać na zdjęciu 2. Podczas doświadczenia przy 7 psu, przeprowadzonego w dwóch wariantach: na pożywce sztucznej i naturalnej wodzie bałtyckiej, zaobserwowano różnice w rozwoju komórek H. akashiwo (wykres 2). H. akashiwo lepiej rozwija się w próbie hodowanej na naturalnym podłożu bałtyckim niż w wodzie przygotowanej sztucznie o tym samym zasoleniu. Można założyć, że w Bałtyku Południowym istnieją dodatkowe czynniki stymulujące rozwój liczebności populacji glonu. Przy 20 psu H. akashiwo rozwija się wolniej niż w próbie kontrolnej (wykres 3); może to zastanawiać, ponieważ testowany szczep H.akashiwo pochodził z rejonu, gdzie zasolenie wody znajduje się w przedziale 20-26 psu, a średnia temperatura wody latem wynosi 16°C. Najprawdopodobniej komórki H.akashiwo w tym regionie rozwijają się w dni, kiedy temperatura wody jest wyższa od średniej letniej. Martinez (2010) w swojej pracy udowodniła, że im wyższa temperatura inkubacji, tym większe tempo wzrostu liczby komórek tego glonu w danym zasoleniu [5]. Przy 36 psu przyrost H. akashiwo był większy niż w próbie kontrolnej (wykres 4). Świadczy to o tym, że przy temperaturze wody 15°C taka wartość zasolenia jest dla jego rozwoju optymalna. Drugie doświadczenie dotyczyło wzrostu populacji H. akashiwo przy różnych stężeniach soli biogenicznych. Wykres 5 przedstawia porównanie trzech różnych prób badawczych w stosunku do próby kontrolnej, tj. dwa podłoża, w których sole biogeniczne zostały dodane w stosunku Redfield’a (do jednego z wariantów dodano krzemu, a w drugim komórki hodowane były na pożywce bez krzemu), trzecią próbą badawczą było podłoże przygotowane według pożywki f/2 bez krzemu. Stosunek Redfield’a wyraża w komórkach organizmów fitoplanktonowych relację azotu do fosforu, a dla komórek zawierających krzem - do tego pierwiastka (16N:P:15Si). Jako pierwszy ten stosunek wyznaczył i opisał amerykański oceanograf Alfred C. Redfield w swoim artykule opublikowanym w 1934 r. Wyznaczył on ten stosunek na podstawie zawartości pierwiastków w komórkach fitoplanktonu ze wszystkich regionów świata i stwierdził jego zgodność z proporcją tych pierwiastków w wodzie morskiej. Podczas doświadczenia zaobserwowano najwyższe tempo wzrostu populacji na podłożu, do którego sole fosforu i azotu zostały dodane w stosunku Redfield’a i wyniosło 0,149 d-1, a najniższe odnotowano w próbie badawczej f/2 (bez Si) i osiągnęło wartość 0,087 d-1. Oznacza to, że do hodowli H. akashiwo bardziej trafną jest pożywka przygotowana według proporcji Redfield’a. Biorąc pod uwagę fakt, że w pożywce (Red bez Si) jest najwyższe tempo wzrostu, można wywnioskować, iż komórki H. akashiwo nie mają w swojej budowie krzemu. Niemniej jednak, kiedy porównamy wzrost komórek hodowanych na pożywce f/2 z hodowlą na pożywce f/2 bez krzemu, można stwierdzić, że wyższe jest tempo wzrostu na pożywce f/2 z krzemem, co oznacza, że niewielka ilość krzemu może być korzystna dla wzrostu liczby komórek tego glona.

Wykres 6 pokazuje, jaki wpływ na rozwój H. akashiwo mają różne ilości azotu. W próbie badawczej bez tego pierwiastka ilość komórek ostatniego dnia eksperymentu jest mniejsza od początkowej ich liczby, a tempo wzrostu, jako jedyne w doświadczeniu 2, jest ujemne i wynosi -0,05 d-1. Natomiast w próbie z podwójną ilością azotu końcowa liczba komórek jest znacznie wyższa niż na początku doświadczenia i w próbie kontrolnej. Oznacza to, że azot jest niezbędny do wzrostu H. akashiwo. Na wykresie 7 pokazano wpływ różnych ilości fosforu na rozwój H. akashiwo. Przez cały czas doświadczenia, aż do dnia 14, liczba komórek w próbie z podwójną ilością fosforu jest większa niż w próbie kontrolnej. Dopiero 14 dnia sytuacja odwraca się i liczba komórek spada, a na dodatek jest mniejsza niż w próbie kontrolnej. Wynika z tego, że komórki zużyły już zawarty w pożywce fosfor do wzrostu i procesów życiowych. Porównując pożywkę, do której nie dodano fosforu, z pożywką bez azotu, możemy stwierdzić że brak tego pierwszego pierwiastka nie wpływa tak bardzo na wzrost ilości komórek jak niedobór azotu. Tempo wzrostu w próbie bez fosforu wynosi 0,06d-1 i jest o 0,01d-1 większe od tempa wzrostu komórek w próbie bez azotu. Natomiast tempo wzrostu w próbie badawczej z podwójną ilością fosforu jest mniejsze od tempa wzrostu w próbie z podwójną ilością azotu i wynosi 0,09 d-1. Według moich badań najbardziej istotnym pierwiastkiem (spośród testowanych w tym doświadczeniu) potrzebnym do rozwoju H.akashiwo jest azot, a najmniej istotnym jest krzem. Miejscem w Morzu Bałtyckim (wzdłuż polskiej linii brzegowej), w którym występuje najbardziej zbliżony stosunek azotu do fosforu do stosunku Redfield’a (16:1) i do stosunku w pożywce f/2 (18:1) jest zewnętrzna Zatoka Gdańska, gdzie stosunek ten wynosi średnio 22:1. W pożywce z podwójną dawką azotu stosunek azotu do fosforu wynosi 36, i jest on porównywalny z proporcją tych pierwiastków w Zatoce Pomorskiej (średnio 43,7:1). Średnie zasolenie w Morzu Bałtyckim wynosi 7 psu [7]. Udowodnione zostało w pracy opublikowanej przez Martinez (2010), że szczepy o szerokim zakresie tolerancji na zasolenie są w stanie przetrwać w zasoleniu wynoszącym 5 psu, jednakże ilości zakwitowe glon uzyskuje w zakresie tolerancji od 10 do 40 psu [5]. Biorąc pod uwagę warunki panujące w Bałtyku Południowym, można wywnioskować, że gdyby taki szczep został zawleczony na ten teren mógł by się on rozwijać, jednakże nie osiągnął by on wartości zakwitowej, a tym samym nie spowoduje toksycznych zakwitów, które powodują masowe śnięcie ryb. Podsumowując H. akashiwo nie zagraża ekosystemowi Morza Bałtyckiego. Piśmiennictwo 1. Band-Schmidt C. J., Morquecho L., Hernandez-Becerril D. U., Reyes-Salinas A., Bravo-Sierra E., (2004). Raphidophyceans on the coasts of Mexico, Hydrobiologia, 515 (1–3), 79–89 2. Guillard, R.R.L. and J.H. Ryther. (1962). Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239. 3. Hara Y., Chihara M. (1987). Morphology, Ultrastructure and Taxonomy of the Raphidopycean Alga Heterosigma akashiowo. The Botanical Magazine, Tokyo, 100:151-163. 4. Herndon J., Cochlan W. P., (2007). Nitrogen utilization by the raphidophyte Heterosigma akashiwo: Growth and uptake kinetics in laboratory cultures. Harmful Algae 6:260-270. 5. Martinez R., Orive E., Laza- Martinez A., Seoane S. (2010). Growth response of six strains of Heterosigma akashiwo to varying temperature, salinity and irradiance conditions. Journal of Plankton Research 32:529-538. 6. Opracowanie zespołowe pod redakcją : Majewski A., Lauer Z. (1994). Atlas Morza Bałtyckiego, Instytut Meteorologii i Gospodarki Wodnej w Gdyni. 7. Praca wspólna pod redakcją Miętos M., Łysiak- Pastuszak E., Krzymiński W. (2010) Bałtyk Południowy - Charakterystyka wybranych elementów środowiska w 2005 roku. Instytut Meteorologii i Gospodarki Wodnej. Oddział Morski w Gdyni. 8. Ptacnik R., Andersen T., Tamminem T. (2010). Performance of the Redfield Ratio and a Family of Nutrient Limitation Indicators as Thresholds for Phytoplankton N vs. P Limitation. Ecosystems 13:1201-1214. 9. Smayda, T.J. (1998). Ecophysiology and bloom dynamics of Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae). In, D.M. Anderson, A.D. Cembella and G.M. Hallegraeff (eds.) Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms, NATO ASI Series G: Ecological Sciences, Vol. 41, Springer, Berlin, pp. 113-131 10. Tyrrell J.V., Connell L.B., Scholin C.A. (2002). Monitoring for Heterosigma akashiwo using a sandwich hybridization assay. Harmful Algae 1:205-214.